摘要：黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis,MPS)是一种遗传代谢病。人IDUA基因编码的α-L-艾杜糖苷酶(α-L-iduronidase,IDUA)功能异常是导致Ⅰ型MPS的主要病因。本研究拟构建特异性靶向小鼠Idua基因的CRISPR/Cas9编辑系统,用以模拟人IDUA基因突变,为建立精准模拟Ⅰ型MPS的细胞模型和动物模型提供高效基因编辑系统。本研究筛查了人类IDUA基因的致病突变,并将候选突变位点定位于小鼠Idua基因上,作为拟突变位点。然后通过sgRNA的设计、表达质粒构建、转染、药物筛选、TA克隆测序等步骤证明了设计的sgRNA具有高效的打靶效力。本研究结果对深入研究MPS的致病机制和探讨MPS的治疗具有重要意义。

摘要：目的 GAA基因突变是人类II型糖原贮积病的遗传学病因,目前尚无根治方法。文章拟设计可模拟人类GAA基因强致病位点突变的靶向小鼠Gaa基因的CRISPR/Cas9系统,并在细胞水平验证其打靶效力。方法检索OMIM、ExAC以及ClinVar等数据库筛查人类Ⅱ型糖原累积病致病基因GAA的强致病位点。通过人和小鼠GAA蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据定位区域的小鼠基因组DNA序列,设计了3个向导RNA序列(Small Guide RNA,sgRNA)序列。然后构建了3个sgRNA表达载体,并将3个sgRNA表达载体分别与cas9表达质粒共转染小鼠N2a细胞。通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行药物筛选,收取阳性转染细胞。PCR扩增打靶区域DNA片段,利用T7EN I酶切反应和sanger测序初步分析打靶情况。随后通过高通量测序分析基因型和打靶效率。结果根据筛查结果判定人GAA蛋白的***609位点为强致病位点,与小鼠Gaa蛋白的***609位点相对应;根据小鼠Gaa蛋白***609位点的DNA序列,成功构建了3个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序及T7EN I酶切反应表明3个位点均发生了DNA变异;高通量测序结果表明3个位点的突变效率分别为49.45%、71.23%和70.91%。结论成功构建了靶向小鼠Gaa基因的高效CRISPR/Cas9系统,为深入研究Gaa基因的功能以及建立Gaa基因编辑小鼠模型进而探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。

摘要：GALT基因突变是人类I型半乳糖血症的主要病因。拟通过CRISPR/cas9系统打靶小鼠Galt基因以模拟人GALT基因突变,从而为建立精准模拟I型半乳糖血症的动物模型奠定基础。首先分析了我国I型半乳糖血症GALT基因的致病突变位点,并将其定位在小鼠Glat基因上,作为小鼠Galt基因的拟突变位点,然后根据拟突变位点区域的序列设计了sgRNA导向序列,构建sgRNA表达质粒,将其与cas9表达质粒共转染小鼠3T3细胞,通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选阳性转染细胞,提取阳性细胞基因组DNA,PCR扩增打靶位点的DNA片段,通过TA克隆测序鉴定基因编辑情况并分析编辑效率。结果表明,3个sgRNA导向序列均可以通过CRISPR/Cas9系统高效编辑小鼠Galt基因,编辑效率为100%。

摘要：目的 设计并构建靶向Tsc1和Tsc2基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并在细胞水平验证基因编辑效力。方法针对小鼠Tsc1和Tsc2基因分别设计3个sgRNA导向序列,构建sgRNA表达载体,与Cas9表达质粒共转染小鼠N2a细胞,经药物筛选获得阳性细胞后,PCR扩增打靶位点的DNA片段,利用TA克隆测序验证打靶效率。结果 Tsc1基因Tsc1-M-sgRNA2、Tsc1-M-sgRNA3及Tsc2基因Tsc2-M-sgRNA1、Tsc2-M-sgRNA2、Tsc2-M-sgRNA3这5个靶点均发生基因编辑,编辑效率分别为40%、80%、30%、30%和20%。结论 成功构建了有编辑效力的靶向小鼠Tsc1和Tsc2基因的CRISPR-Cas9基因编辑系统。

摘要：TYR基因编码酪氨酸酶,该基因变异影响黑色素的生成,是人类白化病的遗传学病因。研究利用OMIM、ExAC和ClinVar等数据库筛查人TYR基因的强致病突变位点,并通过蛋白序列比对分析将该位点定位于小鼠基因组上,然后基于定位位点的DNA序列和CRISPR/Cas9系统基因打靶的原理设计了3个向导RNA(small guide RNA,sgRNA)。通过sgRNA表达载体的构建、N2a细胞的共转染、药物筛选、PCR产物测序,以及TA克隆测序分析等实验步骤完成了3个sgRNA的打靶效力分析。TA克隆测序分析结果显示3个位点均发生了碱基的随机插入或缺失突变,突变效率均为100%,表明研究成功构建了高效的靶向小鼠Tyr基因,并可模拟人类白化病强致病突变的CRISPR/Cas9基因编辑系统,为进一步制备Tyr基因工程小鼠,深入研究Tyr基因变异的致病机制和探寻可靠治疗手段奠定了基础。

摘要：目的:单纯型大疱性表皮松解症(EBS)是一种单基因遗传性皮肤疾病,KRT5基因突变是其主要的遗传学病因。本研究在综合分析人KRT5基因的致病突变位点后,在其附近设计、合成3条sgRNA序列,并构建靶向小鼠KRT5基因的CRISPR/Cas9系统,以模拟人KRT5基因的致病突变。方法:分析数据库中人KRT5基因的致病突变位点,设计3条小鼠拟突变位点sgRNA序列;构建pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒,然后采用Lipofectamine3000转染试剂将pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒与pST1374-NLS-flag-linker-Cas9表达质粒共同转染入小鼠N2a细胞,再以嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行筛选;采用PCR产物测序和TA克隆测序鉴定突变序列,分析打靶效力。结果:成功构建了3个pGL3-U6-KRT5-sgRNA表达质粒,将其转入小鼠N2a细胞后,打靶KRT5基因的效力最高为64.29%,最低为16.67%。结论:设计的CRISPR/Cas9系统可以有效打靶小鼠KRT5基因,为后续建立KRT5基因编辑的小鼠模型,探讨KRT5基因在EBS发生、发展中的作用和机制奠定基础。

摘要：盆景是一种美妙的艺术品,它有机的结合了自然美和艺术美。在园林景观设计中,如果能够合理的应用盆景元素,将会产生与众不同的美。本文以山石盆景为例,分析了盆景元素在园林景观设计中的应用,希望可以提供一些有价值的参考意见。

摘要：目的构建靶向小鼠miR let-7a的高效CRISPR/Cas9系统。方法根据小鼠miR let-7a的两个编码位点let-7a-1和let-7a-2的编码序列各设计了两对dual-sgRNAs导向序列,通过sgRNA表达载体的构建、小鼠N2a细胞的共转染、药物筛选、阳性细胞PCR产物测序以及TA克隆测序分析等实验步骤完成了4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效力分析。结果所构建的4对打靶载体在细胞中发挥了作用,打靶位点均出现了碱基插入或缺失,药物筛选阳性细胞打靶位点RCR产物Sanger法测序峰图在4个靶点位置均有套峰出现。TA克隆测序结果表明本研究设计的4对dual-sgRNAs导向序列的打靶效率分别为42.10%、62.50%、52.63%和47.37%。结论本研究所设计的4对dual-sgRNAs导向序列均可以有效介导Cas9蛋白切割小鼠miR let-7a,形成突变效应。为后续miR let-7a作用靶点的深入挖掘,阐明其发挥抑癌功能的作用机制提供了依据。

摘要：目的使用CRISPR/Cas9系统靶向小鼠ATP7B基因,建立高效的ATP7B基因CRISPR/Cas9编辑系统,模拟人ATP7B基因突变,为更深入地开展威尔逊病(WD)分子机制研究和疾病干预奠定基础。方法选择我国WD的热点突变,对应小鼠ATP7B基因上的突变区域,设计单向导RNA(sgRNA),构建表达质粒,并与Cas9表达质粒共转染到小鼠N2a细胞,采用药物(嘌呤霉素和杀稻瘟菌素)筛选阳性细胞并提取gDNA,将目标位点的DNA片段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,然后通过TA克隆序列结果分析对目标基因的打靶效率。结果成功设计sgRNAs序列,并使用CRISPR/Cas9系统编辑了小鼠ATP7B基因,编辑效率为53.85%,创建了ATP7B基因突变细胞模型。结论通过靶向小鼠ATP7B基因,成功构建CRISPR/Cas9系统,这对深入研究WD的致病机制、探讨WD的治疗具有重要意义。

摘要：目的:ABCB11基因突变是肝内胆汁淤积症2型(PFIC-2)的主要病因,本研究试图构建特异性靶向小鼠Abcb11基因的CRISPR/Cas9系统,并检测该系统的基因编辑效率。方法:根据小鼠Abcb11基因的DNA序列,设计3条sgRNA导向序列,通过构建sgRNA表达载体,将sgRNA质粒和Cas9质粒一起转入N2a细胞,药物筛选,阳性细胞DNA的PCR产物测序以及TA克隆测序等实验,完成基因编辑系统构建及效率检测。结果:sgRNA3导向序列可用于编辑小鼠Abcb11基因,编辑效率为61.54%。结论:靶向小鼠Abcb11基因的编辑系统构建成功,且有较高的编辑效率,为后续建立精准模拟人类PFIC-2疾病的小鼠模型以及临床治疗奠定了基础。