摘要：在哺乳动物细胞中,利用同源引导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因编辑策略能够实现精准的点编辑和敲入,但是HDR的低效性严重制约了该策略在精准医疗和分子设计育种中的应用。鉴于HDR机制所需的供体DNA模板不能自主募集到基因组双链断裂(double-stranded break,DSB)处,本课题组提出了供体适配系统(donor adapting system,DAS)的概念并开发出CRISPR/SpCas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统。由于SpCas9蛋白分子较大,与Gal4BD适配器结合不利于表达、病毒载体包装及活体递送等过程,因此本研究进一步采用两种小型化Cas蛋白——路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源SlugCas9变体SlugCas9-HF与氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)源AsCas12a,开发了新型的CRISPR/Gal4BD-SlugCas9和CRISPR/Gal4BD-AsCas12a供体适配基因编辑系统。通过SSA活性报告实验初步证明了Gal4BD与SlugCas9、AsCas12a N-端融合对其打靶活性影响较小。通过HDR效率报告实验进行功能验证并优化供体设计方案,结果表明:对于CRISPR/Gal4BD-AsCas12a DAS,适配器结合序列(binding sequence,BS)与供体5′-端融合(BS-dsDNA)效果较好;对于CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS,则BS与供体3′-端融合(dsDNA-BS)较佳。最终,利用CRISPR/Gal4BD-SlugCas9 DAS对HEK293T细胞中的EMX1、NUDT5、AAVS1三个基因位点分别实现了24%、37%、31%的精准编辑,相比对照组得到了显著提高。本研究为供体适配基因编辑系统的进一步优化提供了参考和借鉴,为后续动物分子设计育种应用研究提供了新的基因编辑工具。

摘要：近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用***报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。

摘要：在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的SpCas9和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS)。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacIDAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。