摘要：研究旨在探究差异代谢物泛酸(PA)对鸡胚胎干细胞(ESCs)向原始生殖细胞(PGCs)分化过程中的作用,为从代谢角度解析PGCs形成机制提供新的理论基础。试验基于转录组学筛选出PA,通过CCK8与EdU试验探究PA及其代谢抑制剂PZ的适宜添加浓度;最后,分别通过观察细胞形态、qRT-PCR检测PGCs特异标记基因、间接免疫荧光和流式细胞分析等分析PA代谢在ESCs向PGCs分化过程中的作用。结果显示:参与PA代谢相关的基因在ESCs与PGCs中呈现差异性表达,且富集于生殖细胞分化相关的通路(Pantothenate and CoA biosynthesis、TGF-beta signaling pathway和AMPK signaling pathway);PA和PZ的适宜添加浓度分别为20μmol/L和80 nmol/L;PA组在第6天的类胚体数目显著低于PZ组,PA组中CVH和C-KIT3的表达量显著低于PZ组(P<0.01);PA组的DDX4阳性细胞数显著低于PZ组(P<0.01)。结果表明添加PA抑制PGCs的形成,添加PZ促进PGCs的形成。

摘要：近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas以其设计简单,耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用前景的基因靶向敲除技术。就CRISPR-Cas的发现、结构、作用机理以及Cas9/gRNA目前的一些应用进行综述。

摘要：随着人类测序技术的发展与成熟,以锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)以及成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关基因(CRISPR/Cas)为主的基因组编辑技术,在生物、农业、环境及医学等各个领域中发挥着独特的作用。基因编辑技术主要是通过在外源DNA靶位点上产生双链切口,从而诱导出同源重组修复或非同源末端连接,进而实现基因组的编辑。目前ZFN和TALEN技术被广泛运用,虽然在一定程度上获得明显的效果,但因设计复杂,成本较高,使其运用有所局限。CRISPR/Cas技术近年来凭借其高效、精确的编辑成为最新一代的基因编辑技术。本文就以上3种基因打靶技术的作用原理、应用及优缺点作简单概述,为基因编辑的实践应用提供理论基础。

摘要：文章以国家精品在线开放课程《动物遗传学》教学过程为例,对在线开放课程的教学资源、教学结构、教学观念、评价体系进行精心组织与合理设计,旨在使学习活动个性化,强化自主学习能力,提高课程教学质量,为同类课程的建设提供参考。

摘要：试验旨在探究视黄酸介导的Stra8信号在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制。以如皋黄鸡睾丸cDNA为模板扩增Stra8基因CDS区,并与pET-28a载体相连获得原核重组表达载体pET-28a-Stra8,然后转染大肠杆菌BL21感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导外源基因表达,离心收集菌液,并用超声波破碎等方法收集表达的蛋白,用纯化的蛋白作为抗原制备兔源抗体,产生带有免疫抗体的兔血;取全血,经血凝离心等步骤后获取血清,通过SDS-PAGE检测抗体的纯度,将获得的含有多克隆抗体的血清进行ELISA检测效价。结果显示:成功构建pET-28a-Stra8重组载体,IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE分析后显示,STRA8蛋白大小约为55 ku;ELISA检测显示在血清稀释比为1∶256000时P/N=3.3>2.1,达到阳性血清合格标准;Western blotting结果显示制备的多克隆抗体血清可结合STRA8蛋白,该结果为进一步研究Stra8在生殖细胞发生过程中的作用和调控机制提供了基础。

摘要：在哺乳动物中,bmp4可以通过BMP信号通路调节原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的形成,但其在鸡PGCs形成过程中的功能和机制仍不清晰。构建鸡bmp4的过表达及敲除载体,并转染DF-1细胞检测活性。通过同源重组技术构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP重组载体,转染DF-1细胞,RT-qPCR检测bmp4的表达;根据bmp4 CDS序列设计3个敲除靶位点(gRNA),插入PGMLV-GM1构建gRNA序列的重组载体bmp4-sgRNA1、bmp4-sgRNA2和bmp4-sgRNA3。Cas9载体与bmp4-sgRNA载体共转染DF-1细胞,T7E1酶切和TA克隆试验检测敲除载体活性及敲除效率。扩增获得bmp4 CDS全长1546 bp,并成功构建pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP载体,将其转染DF-1细胞后有绿色荧光表达(25.17%±0.007),RT-qPCR检测结果表明,与对照组相比转染pCDH-CMV-bmp4-EF1-copGFP的细胞中bmp4显著上调(P<0.01)。3个gRNA重组载体构建成功,转染DF-1细胞后T7E1酶切检测均有敲除活性,TA克隆结果显示敲除效率分别为6.25%、12.5%和18.75%。结果说明鸡bmp4过表达及敲除载体构建成功,可为后期bmp4功能验证及机制解析等研究提供技术支持。

摘要：研究旨在筛选鸡lncRNA-CEPT8启动子核心区域并验证其启动活性。采用qRT-PCR检测lncRNA-CEPT8在鸡不同组织中表达情况。生物信息学预测lncRNA-CEPT8启动子区域,PCR扩增启动子并构建pEGFP-lncCEPT8重组载体,转染DF-1细胞后48 h进行荧光观察。再构建启动子系列缺失载体(pGL3-p1、pGL3-p2、pGL3-p3、pGL3-p4、pGL3-p5),分别转染DF-1细胞后48 h检测双荧光素酶活性,分析缺失载体的启动活性。结果表明,lncRNA-CEPT8在鸡生殖嵴中特异性高表达,pEGFP-lncCEPT8重组载体转染DF-1细胞后有绿色荧光。缺失载体pGL3-p4与pGL3-p3相比,活性极显著下降(P<0.01)。研究明确了lncRNA-CEPT8上游-1174^-1 bp处为启动子,且-627^-429bp是启动子核心区域,为进一步研究其表达调控机制提供理论依据。

摘要：研究旨在对前期测序筛选到的关键LncPGCT8对鸡原始生殖细胞(PGCs)形成的影响进行深入探究。试验通过qRT-PCR和组织表达谱分析LncPGCT8在鸡PGCs和生殖嵴中的表达量。在体内外过表达/干扰LncPGCT8,通过qRT-PCR、流式细胞术、间接免疫荧光和免疫组织化学染色检测体内外PGC形成效率。结果显示:LncPGCT8在鸡PGCs和性腺中均显著高表达(P<0.05),过表达LncPGCT8组PGCs形成效率显著高于对照组(P<0.05),干扰LncPGCT8则会显著降低PGCs形成数量(P<0.05)。结果表明LncPGCT8在体内/外均促进鸡PGCs形成,为提高体外诱导PGCs效率奠定理论基础。

摘要：为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测。同时用Oct4启动子–1516^+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性。结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游–1516^+30 bp,基本活性区域为–238^+30 bp;在–1516~–946 bp、–615~–96 bp区域存在正调控元件,在–1936~–1516 bp、–946~–615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;–1516^+30 bp片段能够启动GFP的表达。研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础。

摘要：本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402^-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334^+1bp区域的启动子活性最强,-402^+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334^-971bp、-587^-147bp区域存在正调控元件,-1 976^-1 334bp、-971^-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。