摘要：目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni+鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。

摘要：将以“立德树人”为根本任务的课程思政内容有机融入实验动物学教学体系,会对学生的思想意识及行为举止产生潜移默化的影响。本文结合实验动物学的课程设计及专业特色,探讨实验动物学所蕴含的思政元素,提出针对不同章节内容设计课程思政有机融入的形式和方法,同时凝练出实验动物学教学体系中课程思政的典型案例及有机融入特色做法。实践证明将课程思政元素有机融入实验动物学教学体系,可进一步增强教师的课程思政意识及能力,从而有效提升学生的综合素质,增强课程思政铸魂育人的实效性。

摘要：目的:构建一种肿瘤诊断和治疗一体化药物,并利用肝癌动物模型开展诊疗效能评价。方法:利用多孔金属有机骨架材料ZIF-8,通过配位作用同时对化疗药物阿霉素(DOX)和近红外荧光染料IR-820进行负载。而后,利用超声的方法在ZIF-8-IR-820-DOX表面修饰了红细胞膜以提高载药体系的生物安全性和稳定性,得到具有生物伪装特性的pH响应型ZIF-8-IR-820-DOX@RM纳米颗粒。最后,通过对该药物体系的粒径、表面电位、形貌等理化性质进行表征,并利用肝癌动物模型验证该药物的诊断和治疗效能。结果:成功构建了一款红细胞伪装的金属框架纳米诊疗一体试剂,该试剂具有较好的pH相应性,在肿瘤pH 5.5条件下,药物的释放率达到98.4%,而在机体正常pH 7.4条件下,释放率仅为15.3%。在小鼠肝癌动物模型的诊疗过程中,能通过近红外荧光较好的识别肿瘤的位置和大小,且对小鼠肿瘤具有较好的治疗效果。结论:本研究所构建的ZIF-8-IR-820-DOX@RM能通过肿瘤处增强的渗透性和保留(EPR)效应,精准的到达肿瘤部位,并利用pH响应性,在肿瘤酸性环境中精准释放携带的抗肿瘤药物和近红外荧光成像试剂,实现对肿瘤的诊断和治疗一体化设计。为肿瘤治疗的相关研究提供了一种思路和借鉴。

摘要：目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与pGEM T easy载体连接后测序 .将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆 ,分别命名为AZ pcD NA3 EF 和EZ pcDNA3 AF,将重组质粒电转CHO细胞 ,RT PCR检测融合蛋白mRNA的表达 ,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达 ;用重组质粒免疫BALB/c小鼠 ,ELISA测定特异性抗体的滴度 .结果 :PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致 .RT PCR可检测融合基因转录出mR NA ,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光 ,AZ pcD NA3 EF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 0 0 0 ,EZ pcD NA3 AF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 5 0 0 .结论 :Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功 。

摘要：目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。

摘要：目的:融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64ESAT6,为结核病的预防提供可供选择的有效亚单位疫苗.方法:设计含不同酶切位点的mpt64和esat6引物,采用PCR的方法从结核分枝杆菌毒株H37RvDNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与Teasy载体连接测序.将测序正确的mpt64和esat6按照不同的酶切位点克隆入pProEXHT表达载体,挑选出阳性克隆,将诱导的表达产物进行SDSPAGE蛋白电泳分析,同时与6×His的mAb进行Westernblot分析,并用NiNTA亲合柱纯化表达产物.结果:PCR获得的mpt64和esat6序列与GenBank报道的完全一致.两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物Mr为38×103,与预计大小相吻合.Westernblot结果显示,在Mr约38×103处有表达产物与6×HismAb特异性结合带.表达产物为包涵体,通过NiNTA纯化系统,可得到纯化的目的蛋白.结论:结核分枝杆菌的分泌蛋白MPT64和ESAT6被成功的融合表达,有望为结核的临床判定提供有效的诊断试剂.

摘要：背景:一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体,可提高转染和表达效率。目的:利用多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin,MUC1)多肽骨架中含有许多连续重复系列,构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。设计、时间及地点:基因重组体设计实验,于2005-09/2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。材料:真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠,pGEM-3zf(-)-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及*** DH5α为自备,雌性BALB/c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法:将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。主要观察指标:通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果:酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。结论:成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM-CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。

摘要：目的 利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法 针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果 设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论 设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。

摘要：目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。

摘要：目的应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成,sgRNA退火后克隆入p X330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠(F0)与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。