摘要：目的:构建特异性BCR/ABL的siRNA真核细胞表达载体并探讨其对K562细胞BCR/ABL的干扰和生长增殖的影响。方法:根据GenBank数据库提供的BCR/BAL基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(Small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER117和pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;该载体带有zeocin药物抗性和受四环素(tet)调控的开关基因,通过Lipofectamine 2000转染K562细胞,并筛选出阳性K562细胞克隆。采用TaqMan real-time quantitative RTPCR(RQ-PCR)和Western blot技术检测BCR/ABL mRNA和P210蛋白表达;台盼蓝染色法观察细胞的生长增殖,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡。结果:构建BCR/ABL融合基因siRNA真核表达载体pTER117和pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。用筛选出重组载体转染阳性K562细胞克隆,经过四环素诱导基因表达后,细胞的生长增殖明显受到抑制;pTER117和pTER363诱导K562细胞48 h和72 h后,其凋亡率分别为34.4%、31.8%和58.1%;54.6%;BCR/ABL的mRNA表达明显下调,分别为诱导前的10%、18%和8.5%、16%;P210蛋白表达下降明显,几乎检测不到表达。结论:BCR/ABL融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞BCR/ABL的表达,抑制细胞生长,诱导细胞调亡。

摘要：目的 系统评价参麦注射液治疗肿瘤放化疗后白细胞减少症的疗效。 方法 计算机检索PubMed（1966～2013.6）、The Cochrane Library（2013年第5期）、Web of Science（1980～2013.6）、VIP（1989～2013.6）、WanFang Data（1990～2013.6）、CNKI（1980～2013.6）和CBM（1981～2013.6），查找国内外已发表的关于参麦注射液治疗肿瘤放化疗患者白细胞减少症的随机对照试验（RCT）。由2位研究者根据纳入与排除标准独立进行文献筛选、资料提取和质量评价后，采用RevMan 5.2软件进行Meta分析。结果 最终纳入11个研究，共1 009例患者。Meta分析结果显示：参麦注射液在显效率［RR=1.57，95%CI（1.39，1.78），P〈0.000 01］及总有效率［RR=1.27，95%CI（1.19，1.36），P〈0.000 01］方面优于常规口服升白药，但两者有效率差异无统计学意义［RR=0.90，95%CI（0.74，1.09），P=0.27］。结论 参麦注射液治疗肿瘤放化疗后白细胞减少症的疗效优于常规口服升白药物。但受纳入研究的数量及质量限制，本系统评价结论仍需进一步开展更多大样本、严格设计的RCT加以验证。

摘要：背景:目前尚未发现骨髓间充质干细胞独有的标志分子,给其鉴定带来一定困难。BrdU标记不存在放射性污染,有研究认为在不受到紫外线照射的条件下,BrdU标记后对细胞功能无损害。目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外鉴定和标记的方法,并观察其生物学特性。设计、时间及地点:细胞观察,于2007-06/12在解放军兰州军区兰州总医院完成。材料:成人骨髓来自5例健康志愿者。BrdU为美国Sigma公司产品。方法:采集成人骨髓10mL,密度梯度法分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,调整细胞密度为2×108L-1进行扩增培养。取第3代骨髓间充质干细胞,加入成骨诱导培养基,行碱性磷酸酶染色;加入成脂诱导培养基,行油红O染色;加入终浓度为5,10,15μmol/LBrdU溶液,孵育12,24,48,72,96h后行免疫细胞化学染色。主要观察指标:倒置光学显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪鉴定细胞表型,成骨及成脂诱导分化结果。BrdU阳性标记率及标记后细胞生长情况。结果:①体外培养的成人骨髓间充质干细胞形态均一,为梭形或纺锤形的成纤维细胞样外观;表达CD44和CD71,不表达CD34和HLA-DR;可定向诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。②大部分骨髓间充质干细胞标记后核抗BrdU染色阳性,随着标记浓度的升高和标记时间的延长,BrdU阳性率逐渐增高,终浓度10μmol/LBrdU标记72h后阳性率达90%以上,且连续传9代均可检测到BrdU阳性细胞。第3代骨髓间充质干细胞90%处于G0/G1期,BrdU标记后88.62%处于G0/G1期,标记前后细胞生长周期无明显变化。结论:通过形态学特征、表面标记和多向分化潜能可以鉴定体外分离培养的细胞为成人骨髓间充质干细胞;BrdU标记可用于成人骨髓间充质干细胞移植入体内后存活、生长和分化的动态示踪观察;BrdU最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72h。

摘要：目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。

摘要：目的:构建抗mdr1RNA干扰真核表达载体。方法:根据Reynolds的设计原则,针对mdr1的序列及二级结构选择了三条靶序列,人工合成三条shRNA序列的编码DNA序列,重组入Pgenesil-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,碱裂解法提质粒,酶切及测序鉴定。结果:用PstI和SalI酶切鉴定质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3均符合设计要求,测序证实序列完全正确。结论:通过酶切和测序鉴定重组质粒Pmdr1sh1、Pmdr1sh2、Pmdr1sh3插入位点正确,与设计序列一致,预期可用于逆转mdr1所致耐药。

摘要：目的:构建特异性的抗慢性髓细胞白血病融合基因bcr/ablmRNA的siRNA真核细胞表达载体,探索RNA干扰(RNAi)分子靶向治疗慢性髓细胞性白血病(CML)的作用。方法:根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(SmallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的真核表达载体pTER/shRNA1、pTER/shRNA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果:构建慢性粒细胞白细胞bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER/shRNA1、pTER/shRNA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论:抗慢性粒细胞白细胞bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体的构建成功。