摘要：目的分析低剂量三氯乙烯(TCE)诱导的细胞兴奋效应时,谷胱甘肽转移酶Ω-1(GSTO-1)的表达变化。方法利用前期的双向电泳和质谱结果,参照前期兴奋效应的剂量设计,提取染毒细胞的mRNA和总蛋白,进一步使用实时定量RT-PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白水平上验证GSTO-1的表达变化。结果 Western blotting分析发现,0.1mmol/LTCE剂量组能诱导GSTO-1蛋白表达是对照组的2倍,但随着剂量的增加,蛋白表达改变不明显(与对照组相比,P<0.05)。RT-PCR结果提示:低剂量TCE能诱导GSTO-1基因表达增加,随着剂量的增加,表达反而有所减少。结论低剂量TCE能诱导GSTO-1基因及蛋白表达增加。

摘要：目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体(EGFP)的融合表达质粒pEGFP-N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和Kpn I酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA,以逆转录后cDNA为模板,PCR扩增获得SET基因片段,经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP-N2载体中,获得重组质粒pEGFP-N2-SET。以LipofectamineTM 2000为载体,将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果经DNA测序鉴定证实,pEGFP-N2-SET重组质粒构建成功,经荧光倒置显微镜观察,证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。

摘要：目的建立真核质粒载体介导的人SET基因RNA干扰表达体系,并检测其在肝细胞中对SET蛋白表达的影响,为研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性的作用打下基础。方法设计并合成2对人SET基因特异性短发夹RNA(short hair-pin RNA,shRNA)寡核苷酸链,退火形成双链DNA后插入到真核表达质粒psiRNA-hH1 neo中产生shRNA重组质粒载体,经酶切和测序鉴定成功后,转染至L-02肝细胞中,48h后收集细胞提取总蛋白,Western blotting检测干扰后SET蛋白的表达。结果 shRNA重组质粒的酶切和测序鉴定均正确,Western blotting结果显示重组质粒psiRNA1组的干扰效果较好,对SET蛋白表达的抑制率达60%左右,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体,其能有效地抑制肝细胞内SET蛋白的表达,为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。