摘要：美国白蛾(Hyphantria cunea)是桑树的重要害虫。为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白对该虫的作用机制,利用已知昆虫氨肽酶N基因序列设计引物,以美国白蛾中肠cDNA为模板,利用RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因hcapn1全长序列(GenBank登录号:KP053647)。该基因开放阅读框为3 000 bp,编码999个氨基酸,预测蛋白质的分子质量和等电点分别为113.14 kD和4.85。设计去信号肽引物PCR扩增获得hcapn1基因序列,构建原核重组表达载体pET30a-hcapn1,诱导表达的HcAPN1重组蛋白约110 kD。将苏云金杆菌Cry1Ac、Cry2Ab33和Cry9Ea6原毒素经胰蛋白酶消化后与HcAPN1重组蛋白分别进行体外配体印迹试验,发现HcAPN1重组蛋白与Cry9Ea6结合,而不与Cry2Ab33、Cry1Ac发生特异结合,推测HcAPN1可能为Cry9Ea6在美国白蛾中肠的受体蛋白。分别设计引物扩增HcAPN1蛋白2个结构域Asp_(34)～Asp_( 527)和Leu_(563)～Gln_(925)的编码序列,在大肠埃希菌中表达获得62 kD和48 kD 2种重组蛋白,体外结合试验显示Cry9Ea6与HcAPN1的结合发生在Leu_(563)～Gln_(925)之间。研究结果为深入理解苏云金杆菌Cry9Ea6蛋白对美国白蛾的杀虫机制提供了基础数据。

摘要：美国白蛾(Hyphantria cunea)是危害桑树的主要害虫之一。为明确苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白Cry对其作用机制,克隆美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因,并对其编码蛋白的时空表达特异性及与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10的结合特性进行分析。根据美国白蛾中肠转录组数据获得碱性磷酸酶基因序列,设计特异引物,PCR扩增得到美国白蛾中肠碱性磷酸酶基因全长,命名为hcalp1(GenBank登录号为MH796758)。该基因开放阅读框为1 629 bp,编码542个氨基酸,预测蛋白质分子质量和等电点分别为60413 kD和583。实时荧光定量PCR和Western blot结果表明,hcalp1在美国白蛾4龄幼虫表达量最高,HcALP1蛋白在4龄幼虫中肠中的表达量也最高。构建原核重组表达载体pET30a-hcalp1,IPTG诱导表达获得分子质量约为70 kD的重组HcALP1蛋白;将Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10原毒素分别经胰蛋白酶消化后与HcALP1重组蛋白进行体外配体印迹试验,发现HcALP1重组蛋白可与Bt Cry1Ab35、Cry1Ac和Cry9Ea10发生特异结合,推测HcALP1可能为3种Bt蛋白的中肠受体蛋白。