摘要：为建立检测牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的恒温隔绝式RT-PCR(iiRT-PCR)方法,本研究根据BRSV N基因序列设计并合成一对引物和探针,通过反应体系和条件的优化,初步建立了检测BRSV的iiRT-PCR方法。利用该方法对BRSV、牛病毒性腹泻/粘膜病病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛鼻病毒(BRV)、牛腺病毒3型(BAV-3)、多杀性巴氏杆菌(***)、溶血性曼氏杆菌(***)和牛支原体(***)等临床可引起牛呼吸道疾病综合征的病原检测,结果显示,该方法仅特异性检测BRSV,对其它病原检测结果均为阴性,特异性强;将BRSV重组质粒标准品10倍倍比稀释(3.45×105拷贝/μL~3.45×10^(-1)拷贝/μL)后,利用该方法分别检测,结果显示,该方法对该重组质粒标准品的检测限为3.45拷贝/μL,敏感性高;重复性试验结果显示,批内重复性变异系数为1.92%~2.12%,批间重复性变异系数为1.67%~1.89%,重复性好。采用该iiRT-PCR方法和文献报道的3种方法同时对采自5个省146份肉牛呼吸道疾病患牛的鼻腔拭子和40份牦牛肺脏样品进行检测,结果显示,本实验建立的iiRT-PCR方法对146份鼻腔拭子中BRSV的平均检出率为36.30%,场阳性率为75.00%,5个省均有检出;牦牛肺脏样品中BRSV的检出率为45.00%,场阳性率为100%,该结果首次证实BRSV在牦牛中的存在和流行。另外本实验建立的方法对临床样品的检出率高于其他3种方法。本实验建立的iiRT-PCR方法配合使用PetNAD核酸萃取试剂盒和POCKITTM手持式核酸分析仪能够对BRSV现场检测,结果显示其与实验室检测结果一致。本研究为BRSV的快速检测提供了有利工具,丰富了国内BRSV的流行病学资料。