摘要：目的制备重组日本血吸虫核糖核酸酶T2蛋白(rSj RNase T2),并分析其生物学功能。方法根据编码RNase T2开放阅读的基因序列设计、合成一对5′端带有酶切位点的引物。采用PCR方法从质粒CP1412/PEU-GST中扩增编码RNase T2蛋白成熟肽的基因片段,亚克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a。将重组表达质粒转化到*** BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍螯合亲和层析胶在变性条件下纯化rSj RNase T2蛋白。纯化蛋白通过尿素浓度梯度透析的方法进行复性,制备可溶性rSj RNase T2。以酵母RNA为底物进行消化,采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测rSj RNase T2酶活性。用纯化的rSj RNase T2免疫小鼠,采用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清特异抗体水平,观察其抗原性;采用检测Western blot抗rSj RNase T2抗体IgG与成虫可溶性虫抗原、成虫外分泌抗原、虫卵可溶性抗原和虫卵外分泌抗原的反应性,并观察Sj RNase T2在虫体中的分布。以rSj RNase T2刺激巨噬细胞RAW264.7,通过流式分析观察RAW264.7细胞表面标志物CD16/32、CD206表达水平的变化,采用RT-PCR检测RAW264.7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶基因mRNA的表达水平,采用ELISA检测RAW264.7细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化,以观察Sj RNase T2的免疫调节功能。结果重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a构建成功,经IPTG诱导,能表达重组Sj RNase T2蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,经过复性能获得部分可溶性蛋白。rSj RNase T2具有酶活性,能够水解酵母RNA。ELISA检测rSj RNase T2免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1︰200 000,该抗血清能识别来源于血吸虫虫卵及虫卵外分泌抗原中的天然RNase T2。rSj RNase T2可诱导巨噬细胞向M2型方向转化,表达高水平的IL-10、精氨酸酶及CD206表面分子。结论 rSj RNase T2表达成功。该蛋白具有天然的酶学特性和抗原性,能调节巨噬细胞向M2型方向分化。

摘要：目的对带有信号序列的日本血吸虫虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列进行分析。方法根据日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列的cDNA片段序列设计合成基因特异性引物。以虫卵的第一链全长cDNA为模板,采用套式PCR,快速扩增带信号序列的虫卵毛蚴cDNA的5′、3′末端片段,将特异性扩增片段进行TA克隆与序列分析。将每个带信号序列的虫卵毛蚴cDNA片段序列与其5′、3′末端片段序列进行比对和拼接,构建每个带信号序列的虫卵毛蚴基因的完整全长cDNA序列,对部分带信号序列虫卵毛蚴基因的信号序列所对应的基因组序列结构进行分析。结果本研究分析了30个带有信号序列的cDNA片段,其中16个片段的5′、3′末端cDNA序列被成功扩增,并测定了它们的DNA序列,通过序列比对和拼接,获得了该16个虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列。对开放阅读框演绎的氨基酸序列进行分析,发现基因SjP4001与SjP1531的信号肽序列完全相同,而基因SjP3742和SjP1183的信号肽氨基酸序列甚为相似,从而进一步证明不同的基因可拥有相同或相似的信号肽。基因组序列分析表明,基因SjP1183的信号肽基因序列与成熟肽基因序列通过交替拼接(alternativesplicing)方式进行拼接;而基因SjP4001、SjP1531、SjP3742的信号肽基因序列与成熟肽基因序列之间可能是通过转移拼接的方式进行拼接。结论确定了16个带有信号序列的虫卵毛蚴基因的全长cDNA序列,虫卵毛蚴基因可通过交替拼接方式或转移拼接方式获得信号肽序列。