摘要：参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。

摘要：为了建立一种便捷、灵敏的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)检测技术,本研究根据exJSRV LTR设计2对特异性引物,建立JSRV的LAMP(loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增)检测方法,对反应体系中的MgSO4Betaine Bst DNA PoLymerase dNTP引物浓度等分别进行了优化,并进行敏感性和特异性试验。结果表明:所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92%和100%。该方法为绵羊肺腺瘤病的临床检测和基层检疫提供了一种简便、实用的方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用。基于本技术的专利已获国家知识产权局批准(专利号ZL 2012 1 0274280.7)。

摘要：参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。

摘要：为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒DNA的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。

摘要：根据已发表的绵羊透明质酸酶2(Hyal2)(GenBank中登陆的NM_001009754)基因序列设计两对引物,运用重叠PCR(overlapping PCR)方法,扩增出透明质酸酶2基因,将其亚克隆于PMD19-T载体中,并进行序列测定与分析。该基因包含一个由1431bp组成的完整开放阅读框(ORF),编码476个氨基酸。序列比较显示:该基因与模板核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性99%。系统进化分析,显示目的基因与牛的基因亲缘关系较近。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质为亲水性蛋白。

摘要：为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术分别扩增编码囊膜蛋白(env)基因的表面蛋白(surface protein,SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein,TM)区域基因,通过T-A克隆的方法分别克隆入pGEM-TEasy载体中,然后利用设计的起始密码、终止密码以及相应酶切位点的引物,把env基因的SU区和TM区基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中,分别构建SU和TM的重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入大肠杆菌BL21 CodonPlus中并在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以稳定的包涵体形式高效表达,表达的SU和TM融合蛋白表观分子质量约为68 ku和46 ku,表达量分别占全菌蛋白的25%和30%,并且从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度,是一种理想的免疫原。

摘要：为了构建绵羊透明质酸酶-2(hyaluronidase 2,Hyal-2)的真核表达载体并实现其在牛乳腺上皮细胞内瞬时表达,根据GenBank中绵羊Hyal-2基因序列(登录号:NM_001009754)设计2对引物,并分别在前段上游和后段下游引物5′端引入HindⅢ酶切位点和BamHⅠ酶切位点,同时在上游引物酶切位点后加入KOZAK序列,进行分段PCR扩增。以扩增的两段产物为共同模板运用重叠(overlapping)PCR技术扩增Hyal-2基因全长。通过连接反应将双酶切并纯化后的目的片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1上,并通过脂质体转染法将构建好的真核表达载体转染牛乳腺上皮细胞,运用RT-PCR及West-ern blotting方法分别从核酸及蛋白质水平验证其表达。经测序分析,目的片段与模板核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%,且片段插入方向正确。RT-PCR及Western blotting方法检测均出现目的条带,证明成功构建了绵羊透明质酸酶-2的真核表达载体,并在牛乳腺上皮细胞中获得表达。

摘要：为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDSPAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。