摘要：目的了解新设计的6组CpG分子在动物体内对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组亚单位疫苗免疫效果的提升作用,以初步筛选出有潜力的新型CpG佐剂。方法通过序列检索比对,确定人鼠同源的CpG基序,以不同的组合方式设计出6条不同的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)序列,并人工合成相应6种CpG,分别与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用,已上市的佐剂CpG1018作为阳性对照。以间隔2周的方式免疫BALB/c小鼠2次,免疫后每周取眼眶血检测IgG1和IgG2a指标。2针免疫后21 d处死小鼠,取眼球血检测结合抗体抑制率;取脾脏淋巴细胞进行酶联免疫斑点试验检测。结果初次免疫后14 d,CpG6组小鼠血清IgG2a和IgG1水平分别为3.63±0.27和3.44±1.03,显著高于CpG1018组的2.06±1.30和2.06±0.39。加强免疫后14 d,CpG6组小鼠血清IgG2a水平为6.52±0.21,高于CpG1018组的6.33±0.40。在针对原型株的结合抗体抑制率指标上,初次免疫14 d、加强免疫21 d后,各组间差异存在统计学意义(F=13.66、12.58、19.38和19.38,P均<0.001)。初次免疫14 d后,稀释10倍血清中CpG6组小鼠血清抑制率为(64.67±20.41)%,高于CpG1018组[(27.84±20.23)%],差异有统计学意义(t=2.70,P=0.031);加强免疫21 d后,稀释1000倍的血清中CpG6组小鼠血清抑制率针对原型株[(89.71±4.83)%]和Delta株[(79.04±6.32)%]的抑制率水平均显著高于CpG1018组[(70.84±17.20)%和(52.61±14.22)%],差异有统计学意义(t=2.36,P=0.046;t=3.80,P=0.005)。酶联免疫斑点实验结果显示,CpG1018组针对SARS-CoV-2原性株敏感和Delta突变株敏感的特异性IFN-γ分泌细胞数与CpG6组相比,差异均无统计学意义(t=0.76,P=0.469;t=0.78,P=0.459);在特异性IL-2分泌细胞数上,两组差异亦无统计学意义(t=0.70,P=0.503;t=0.90,P=0.395)。结论CpG6与SARS-CoV-2重组亚单位疫苗联用,能在疫苗初次免疫后更快速地在小鼠体内产生体液免疫应答,且加强免疫后体液免疫和细胞免疫效果均不弱于已上市的CpG1018佐剂。CpG6有望成为潜在的备选佐剂与疫苗联用。

摘要：目的制备含有L452R和T478K突变位点的新型冠状病毒受体结合域(RBD)-破伤风类毒素蛋白(TT),表达后蛋白免疫小鼠以了解突变体蛋白的免疫原性。方法设计2对新型冠状病毒引物对RBD中的L452R和T478K进行突变,并将TT肽的核苷酸片段嵌入RBD中;利用大肠埃希菌表达系统表达蛋白,借助离子柱层析技术纯化出目的蛋白,复性获得空间构象后通过ELISA、高效液相和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)等进行检定;免疫小鼠后ELISPOT检测其细胞免疫水平;用竞争法ELISA和活病毒中和试验评估其中和抗体对新型冠状病毒流行突变株的抑制能力。结果成功构建了新型冠状病毒RBD的L452R和T478K突变蛋白,蛋白相对分子质量为26390。小鼠免疫后产生了特异性的细胞免疫,突变蛋白组刺激后产生的分泌IFN-γ的效应T细胞为(21.43±11.71)个斑点形成细胞/5×10^(5)个细胞,高于对照组(3.38±2.56)个斑点形成细胞/5×10^(5)个细胞,差异有统计学意义(t=4.17,P=0.003);同时产生了针对新型冠状病毒德尔塔、奥密克戎(BA.1)流行株的高滴度中和抗体,中和滴度几何平均数分别为3012.28和1086.12。结论本研究所构建的L452R和T478K突变蛋白对流行的新型冠状病毒德尔塔、奥密克戎(BA.1)流行株有效,为开发重组广谱的新型冠状病毒疫苗提供依据。