摘要：信号转导和转录活化因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素信号通路中的关键分子,在对抗病毒和其他病原体的免疫反应中发挥重要作用,构建STAT1敲除细胞系有助于研究其在病毒感染过程中的作用与机制。本研究利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)基因编辑技术构建STAT1基因敲除细胞系。首先构建STAT1基因特异性打靶载体,后通过慢病毒转导人非小细胞肺癌细胞系(Human non-small cell lung cancer cells,A549),嘌呤霉素筛选稳定转导的细胞后进行单克隆化,最后对获取的单克隆细胞在分子水平上进行敲除及敲除回补验证,成功构建一株STAT1基因敲除(STAT1 gene knockout,STAT1-KO)的A549细胞,且该细胞系可维持正常细胞活性与增殖能力。以汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染验证,发现在该细胞系中病毒复制水平明显升高。本研究成功构建了一株STAT1-KO A549细胞,可为抗病毒药物和干扰素信号通路研究提供有力工具。

摘要：目的:构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体,并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因,检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果:参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得M和CD40L基因片段,将其与pCI-neo载体相连,测序证实该载体构建成功后,将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO-K1中,利用间接免疫荧光法(IFA)检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论:构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达,为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。

摘要：研究羊布鲁菌外膜蛋白omp2b基因的克隆,原核表达,以及纯化。根据羊布鲁菌M5株外膜蛋白omp2b蛋白基因序列设计引物,扩增出大小约为1 130 bp的目的基因片断,克隆入融合表达载体pGEX-4T-1,构建重组质粒pGEX-4T-1-omp2b。在大肠埃希菌中将该蛋白表达并用亲和层析法纯化。用Western-blot分析方法鉴定纯化蛋白。结果成功构建了pGEX-4T-1-omp2b原核表达载体并在大肠埃希菌中表达了omp2b基因,纯化后所获得的蛋白与目的蛋白大小一致且与兔抗布鲁菌血清发生特异性反应,说明其为布鲁菌omp2b蛋白。本研究成功构建了pGEX-4T-1-omp2b原核表达载体,并且在大肠埃希菌中进行表达,纯化的omp2b蛋白具有良好的免疫原性。

摘要：目的:建立一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法,快速、定量检测汉滩病毒感染中的中和抗体活性。方法:将本室前期制备的抗汉滩病毒高中和活性鼠源性单抗3G1、鼠/人嵌合单抗1D9和感染剂量为100 TCID50的病毒混合液于37℃孵育1 h后感染Vero-E6细胞,提取细胞总RNA。根据GenBank数据库中汉滩病毒76-118株S基因序列设计特异性引物,在上述实验基础上以细胞总RNA为检测样品,建立qRT-PCR快速、定量检测汉滩病毒感染中中和抗体活性的实验方法。结果和结论:建立了一种基于qRT-PCR的微量细胞中和实验改良法,可定量测定汉滩病毒感染中的中和抗体活性,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。