摘要：解旋酶家族是一类对所有生物都至关重要的酶,主要功能是基因解旋,DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶。DEAD-box RNA解旋酶DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。新城疫病毒(NDV)是一种对养禽业危害严重的病原,NDV能够通过多种手段调控宿主先天性免疫,为了探讨DDX21如何调控NDV复制,本研究应用CRISPR/Cas9系统建立DDX21基因敲除的HeLa细胞系,并验证其对NDV复制的影响。针对DDX21基因共设计6条sgRNA,构建敲除载体并电转染细胞,通过药物筛选、亚克隆筛选后,以PCR和Western blot进行敲除效率的双重鉴定,并比较野生型和DDX21敲除细胞中NDV的复制效率。结果显示,由于DDX21对细胞生长至关重要,因此仅获得一株DDX21杂合子敲除细胞,Western blot结果显示DDX21表达量被显著抑制,NDV对在敲除细胞上的复制滴度明显低于野生型细胞,说明DDX21发挥正调控NDV复制的作用,本试验为DDX21调控抗病毒先天性免疫研究奠定了基础。

摘要：课后反思是教师对自己的教学行为批判性地审视,即审视教学设计、教学过程中的成功与不足,肯定成功之处,否定、修正和完善不足之处。教师不断进行教学反思，自身的观察能力、思维能力、文字陈述能力和交往能力将得到不断的培养和训练，教师的进取心、责任心、勇气和意志也将得到增强。因此，反思是教学过程中不可或缺的环节，没有反思就没有教师的专业成长和进步。它是教师专业发展和自我成长的核心因素。笔者认为在课后反思过程中应重视以下几个环节：

摘要：以上海某鸡场分离的1株对LoVo细胞及A549细胞具有良好的溶瘤效果且呈时间依赖性的新城疫病毒(Newcastle diseases virus,命名为SH15)为研究对象,依据Gen Bank中Mukteswar毒株,设计了10对引物以用于扩增SH15的片段cDNA,并对阳性克隆进行菌液PCR鉴定以及测序分析。测序分析比对结果确定,SH15株的全基因组长15 186 bp,在GenBank登录号为KY247177,结合生物学试验确定为中等毒力型。与其他毒株序列分析表明:该毒株与JS/9/05/Go、Mukteswar的全基因组同源性为99.8%,属于NDV的ClassⅡ分支中的基因Ⅲ型。推测SH15的溶瘤能力可能与HN蛋白中H203位点变异有关。本研究为了解新发现的溶瘤NDV毒株的生物学特性及全基因序列,以及以NDV为载体进一步开发肿瘤靶向药物奠定了基础。

摘要：TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒(NDV)引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系(BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR)。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示:重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示:BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞;病毒生长曲线结果显示:强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(5.67,72 h)高于BHK-21-chTIGAR细胞(5.53,72 h)和野生型BHK-21细胞(5.27,72 h);中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(4.90,96 h)要高于BHK-21-chTIGAR细胞(4.57,96 h)和野生型BHK-21细胞(4.67,96 h);弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID50(4.07,96 h)要高于BHK-21-chTIGAR细胞(3.90,96 h)和野生型BHK-21细胞(3.77,96 h)。综上所述,所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。

摘要：受体酪氨酸激酶AXL是TAM家族(由TYRO3、AXL和MERTK组成)的成员之一,在机体的许多生理和病理条件下发挥重要作用。为探究AXL对新城疫病毒(NDV)复制及干扰素刺激基因(ISGs)产生的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计了2条AXL的sgRNA和1条阴性对照sgRNA,并分别插入LentiCRISPRv2中构建LentiCRISPRv2-AXL-1、LentiCRISPRv2-AXL-2及阴性对照质粒LentiCRISPRv2-AXL-control,并经菌液PCR和测序鉴定正确后分别与pSPAX2和pMD2G共转染293T细胞,获得相应重组慢病毒,分别命名为rLenti-AXL1、rLentiAXL2和rLenti-control。同时筛选药物Puromycin对DF-1细胞的最佳使用浓度;将上述慢病毒分别感染DF-1细胞,48 h后利用qPCR检测sgRNA的敲低效果;将敲低效率较高的重组慢病毒感染DF-1细胞,并经最适浓度的Puromycin筛选和亚克隆纯化后获得的细胞分别经qPCR和western blot检测AXL基因及其蛋白水平;将获得的细胞连续传10代后分别取第2、4、6、8、10代细胞经qPCR检测其遗传稳定性。结果显示,2.5μg/mL为Puromycin的最适筛选浓度;qPCR结果显示,rLenti-AXL1和rLenti-AXL2均能敲低DF-1细胞中的AXL基因水平,但后者的敲低效率较高,因此选择rLenti-AXL2进行后续试验;经Puromycin筛选细胞3次后经亚克隆纯化,获得了3株敲低AXL基因的细胞;细胞的qPCR和western blot结果显示,3株细胞中AXL基因及蛋白表达水平均极显著降低;遗传稳定性结果显示,各代细胞中AXL基因的转录水平仍然较低。上述结果表明,获得了敲低AXL基因表达的DF-1细胞系,命名为AXL-KD DF-1细胞。将MOI 1的NDV分别感染DF-1和AXL-KD DF-1细胞后,分别经qPCR和western blot检测Mx1和IFIT5基因的转录水平及细胞中NDV NP蛋白水平。结果显示:无论是否感染NDV,AXL-KD DF-1细胞中Mx1和IFIT5基因的转录水平均显著升高1倍左右(p<0.05);且相比于DF-1细胞,感染NDV的AXL-KD DF-1细胞中NP蛋白的表达量均极显著下降(p<0.0001)。综上结果表明,敲低细胞中的AXL基因后能够抑制NDV复制并且促进Mx1和IFIT5转录水平的显著上调,本研究为了解NDV的致病机制奠定基础。

摘要：目的设计一种新型可伸缩的颈椎椎弓根钉内固定系统,评价其生物力学稳定性。方法收集新鲜成人颈椎标本(C1-T1)6具,采用朱青安方法分别比较A、B、C、D、E组即完整组、破坏组、自体髂骨植骨加AO钢板固定组、自体髂骨植骨AO钢板及后路棘突钢丝固定组与椎弓根钉固定组在前屈(flexion)、后伸(extension)、左/右侧弯(lateral bending)及左/右旋转(rotation)6种运动状态下角位移,评价其生物力学稳定性。结果固定后3组脊柱受试单位在6个方向负载状态下的ROM较破坏组明显减少,3组内固定受试组均能达到有效的生物力学固定效果。但下颈椎椎弓根钉内固定组比前路髂骨植骨AO钢板固定组更能减少生理载荷下的ROM(P0.05)。结论新设计的颈椎椎弓根钉内固定器械能提供有效的生物力学稳定性,可用于临床。

摘要：APOBEC家族成员中AID蛋白具有DNA/RNA编辑酶功能,同时具有抑制病毒增殖的作用,但具体机制尚不明了。本研究首先根据NCBI公布的鸡全基因组序列进行生物信息学分析,预测鸡AID的基因序列并通过设计PCR引物,成功在鸡法氏囊cDNA样品中扩增出鸡AID基因(chAID)。通过建立并优化chAID的实时定量RT-PCR(rRT-PCR)检测方法,对鸡体内AID基因的表达以及其分布情况进行检测;同时通过Western blot试验对chAID蛋白在鸡细胞中的表达进行检测。试验显示,chAID基因能够在鸡细胞以及组织脏器中正常表达。新城疫病毒(NDV)感染鸡原代成纤维细胞、淋巴细胞后能够引起内源性chAID基因水平的上调;SPF鸡感染NDV后,chAID基因在不同组织脏器中均出现上调现象,以免疫器官最为显著。为了进一步验证chAID基因对NDV增殖的影响,进一步检测在细胞中过表达chAID基因对NDV增殖的影响。研究结果表明:重组chAID蛋白具有抗NDV病毒活性,本研究为进一步研究鸡chAID奠定了基础。

摘要：“2019浙江省幼儿教育优秀教学活动评审”教学活动设计方案设计意图:本次活动处于“镜子的秘密”主题行进的中后期,是建立在幼儿已经积累了较为丰富的“镜子成像的秘密”经验基础上生成的活动。大班幼儿已经具备了感知音乐作品节奏、旋律、结构变化的能力,并且会产生个性化的想象和表达。本次活动旨在让幼儿获得有关旋律、节奏、肢体、结构等音乐核心经验;创设探究、合作等多重能力发展的机会,通过科学与艺术的相互作用,在唤醒、梳理和创造性表现相关经验的过程中获得多领域核心经验共同生长;激发幼儿进一步探究镜子组合成像等有趣现象的愿望,推动主题向纵深方向持续发展。

摘要：为进一步了解新城疫病毒(NDV)的遗传进化规律,从疑似NDV感染的鸽群中通过鸡胚接种分离出1株新城疫强毒株,将其命名为Pigeon/China/SHJD13/2017,经噬斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间(MDT)为57.2 h,1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)为2,毒力指标属于强毒NDV。参考GenBank公布的NDV全基因组序列,共设计了11对引物,对其进行全基因组测序,序列测定结果显示:分离株属于基因Ⅶ型NDV,其基因组全长15192 bp,登录号为MK937786,F基因共包含553个aa,裂解位点的氨基酸残基为112 R-R-Q-K-R-F 117,符合NDV强毒株的分子特征。通过序列同源性比对分析,该分离株与鸡源强毒株Chicken/China/SDWF07/2011亲缘关系较近,表明该鸽源分离毒株可能来自于感染的鸡群。

摘要：针对RPL11基因设计三条不同的shRNA,并分别克隆至带绿色荧光标签的pRNAT-U6.1载体,以用于构建RPL11稳定敲减的细胞系。将重组质粒转染至HeLa细胞中并加入G418进行筛选,随后通过有限稀释法将阳性细胞亚克隆纯化。将扩大培养的亚克隆细胞进行Western blot和qPCR实验验证获得RPL11基因稳定敲低的细胞株。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和Puromycin标记法测定RPL11基因稳定敲低细胞系的生长活力和新生蛋白合成能力,结果表明,RPL11基因稳定敲低后并不影响细胞的活力和新生蛋白合成能力,该细胞系为后续研究RPL11的非核糖体功能奠定了基础。