摘要：利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的HPRT基因组片段(不含有第1个外显子)克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。

摘要：目的从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴中克隆DNA聚合酶δ小亚基EgPolD2,进行序列测定和生物信息学分析。方法设计EgPolD2特异性引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴cDNA中克隆EgPolD2基因,然后将其克隆至pMD18-T载体,测序并进行生物信息学分析,半定量反转录PCR分析其在细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡中的表达情况。结果 EgPolD2基因开放阅读框为1 218bp,编码405个氨基酸,等电点为4.74。NCBI保守功能区分析软件预测EgPolD2蛋白第113～378个氨基酸为MPP_PolD2_C结构域。登陆GenBank进行Blast比对,EgPolD2与曼氏血吸虫SmPolD2基因同源性为32.1%,与线虫和人等其他物种PolD2基因同源性在18.3%～22.8%之间。进化树分析表明EgPolD2与SmPolD2相聚集,与其他物种同源性较低。半定量RT-PCR显示,EgPolD2在细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡中均有表达,且表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验成功克隆出细粒棘球绦虫EgPolD2新基因,为进一步研究抗细粒棘球绦虫药物靶标奠定了基础。

摘要：目的构建GST-EM18原核表达质粒,优化EM18-GST重组蛋白诱导表达条件,通过生物信息学预测EM18蛋白的空间结构。方法以pMD18-T/Em18为模板,扩增EM18基因的CDS区,构建pGEX-3X-EM18,设计不同诱导表达条件表达EM18-GST蛋白。通过各种在线网站对EM18蛋白空间结构进行生物信息学预测。结果成功构建GST-EM18原核表达质粒,以1mmol/LIPTG于37℃诱导4h,蛋白表达较好;生物信息学预测EM18蛋白N端为无规卷曲,之后紧连两个α螺旋,C末端为无规卷曲和较短的片层结构。结论成功构建了GST-EM18原核表达质粒,表达的EM18蛋白含有无规则卷曲,可能是抗原表位所在位置。

摘要：目的建立检测泡球蚴感染小鼠IL-17的实时荧光定量RT-PCR方法,并用于泡球蚴病小鼠IL-17基因检测。方法通过腹腔注射100μl泡球蚴组织匀浆液建立泡球蚴感染小鼠模型,感染1个月后处死,提取肝脏总RNA,反转录得到cDNA;登陆GenBank,得到IL-17基因（U43088.1）全序列,选取保守序列,应用pri mer 5设计引物,β-actin作为内参,以10倍梯度稀释IL-17 PCR产物为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR以确定方法的特异性和灵敏度;绘制标准曲线,确定IL-17基因检测的最佳条件。结果用建立的实时定量RT-PCR检测IL-17基因无非特异性扩增,各样品熔解温度均在81.0℃,熔解峰单一;mRNA检出限为1×102pg,106~102pg总RNA均有扩增;泡球蚴感染1个月后,IL-17基因表达显著增加,感染组和对照组分别为（0.008728±0.000984）和（0.003823±0.00082）,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论成功建立了小鼠源IL-17基因实时定量RT-PCR检测体系。经检测,小鼠感染泡球蚴1个月后IL-17基因表达增加,表明IL-17在泡球蚴感染免疫调节中可能起重要作用。

摘要：目的从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴中克隆PDZ结构域蛋白(EgPDZ),进行序列测定和生物信息学分析。方法设计EgPDZ基因特异性引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴RNA中克隆EgPDZ基因并将其克隆至pMD18-T载体,测序确定序列并进行生物信息学分析。结果 RT-PCR扩增出一长度约600 bp的基因,测序显示其长度为627 bp,编码208个氨基酸,等电点为4.76,为一新基因,命名为EgPDZ。SMART功能分析预测EgPDZ蛋白16～88氨基酸为PDZ结构域。同源性比较表明,EgPDZ与多房棘球绦虫EmPDZ同源性为97.60%,与血吸虫和人等其他种类PDZ基因同源性在18.16%～26.42%之间,而PDZ结构域的序列相似度为42.47%～98.63%。进化树分析表明EgPDZ与EmPDZ相聚集,与其他物种同源性较低。结论成功克隆出细粒棘球绦虫EgPDZ新基因,为进一步研究该基因在细粒棘球绦虫与宿主相互作用中的功能奠定基础。