摘要：为建立一种快速、特异、灵敏检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的荧光定量RT-PCR方法,参比NCBI中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对针对PEDV S基因的特异性引物和探针,建立TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,建立的方法与猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒不存在交叉反应,具有较强的特异性;最低检测限度为1.0 copies/μL,比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内、批间重复性试验的变异系数分别在1.0%、2.8%以下,具有较好的重复性;对临床疑似样品进行检测,荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法总符合率为80%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好。

摘要：2020年10月,贵州省安顺市某猪场7日龄仔猪由于腹泻导致大量死亡。为了查明死因,本试验对腹泻病死仔猪肠内容物分别进行了猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测。结果显示,TGEV、PEDV、PDCoV均为阴性,仅PoRV为阳性。参考GenBank中PoRV基因组序列,设计合成1对扩增VP7基因的通用引物并进行该基因片段的扩增和测序。结果显示,该PoRV VP7基因与PoRV G5血清型VP7基因属于同一分支。结果表明,导致该猪场7日龄仔猪死亡的病原体为PoRV G5血清型。

摘要：为比较实验室分离保存的猪轮状病毒田间株(GZAS2020株)与猪三联腹泻活疫苗NX株的差异,参照已发表的A群猪轮状病毒VP4、VP6、VP7序列设计合成3对扩增全基因的通用引物,分别克隆测序GZAS2020株和NX株的VP4、VP6、VP7全基因。采用DNAStar对GZAS2020株和NX株VP4、VP6、VP7这3个主要基因进行核苷酸、氨基酸同源性分析以及遗传进化树构建,结果显示,GZAS2020株与NX株VP4、VP6、VP7基因核苷酸同源性分别为75.2%、90.0%和79.4%,氨基酸同源性分别为78.5%、74.1%和82.4%,根据G/P分类命名法,GZAS2020株属于G5P[13]。与NX疫苗毒株相比,GZAS2020株的VP4基因在359、360、750 bp处存在C、A、C碱基的缺失,在347、348、570、571、572、579、580、581、757 bp处分别插入了C、C、C、A、A、G、G、G、C碱基;VP6基因不存在插入和缺失;VP7基因在258、1 029 bp处分别存在T、A碱基的插入,266 bp处存在1个C碱基的缺失。结果表明,GZAS2020株和NX株在核苷酸位点上有一定的插入、缺失以及突变,导致编码氨基酸有意义突变,致使蛋白抗原表位出现差异。研究结果可为临床疫苗的选用、诊断方法的建立及猪轮状病毒疫苗候选株的筛选提供参考,也丰富了贵州省猪轮状病毒病的流行病学资料。

摘要：为了解引发贵州省某猪场腹泻疫情的猪轮状病毒(PoRV)基因组特征和遗传变异规律,本研究将鉴定为PoRV阳性的腹泻病死仔猪的肠内容物样品处理后接种Vero细胞,传代后经RT-PCR鉴定并测序,结果显示PoRV属于G5P[13]型。通过透射电镜和间接免疫荧光试验鉴定,结果显示:能观察到直径约70 nm的无囊膜的病毒粒子,接种病毒的Vero细胞有特异性的绿色荧光,表明分离获得一株PoRV,命名为GZAS2020株。根据PoRV国内外参考株序列设计11对兼并引物,经RT-PCR扩增该病毒11个节段并测序后拼接,结果显示:该病毒基因组全长18 514 bp。对GZAS2020株全基因组序列同源性分析,对其VP4、VP7氨基酸差异性及基因重组情况分析。结果显示:GZAS2020株11个节段分别与猪、人、熊猫源轮状病毒的同源性最高且遗传进化树处于同一分支,且VP7、VP4、VP6、VP1~VP3、NSP1~NSP5基因与国内外各基因型轮状病毒的同源性分别高达97.2%、95.6%、98.7%、96.3%、94.5%、96.1%、97.6%、96.5%、96.6%、98.3%、98.7%,该株病毒全基因组基因型为G5-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。GZAS2020株VP4存在23个氨基酸位点的点突变(S^(28)L、H^(42)Q、T^(133)A、A^(185)V、N^(194)S、S^(197)N、E^(200)K、I^(209)V、S^(237)P、H^(248)Q、R^(282)Q、T^(294)A、S^(361)T、Q^(362)P、I^(381)V、M^(393)V、N^(447)S、V^(455)A、T^(460)A、M^(466)I、V^(601)A、S^(655)A、S^(681)N),VP7存在20个氨基酸位点的点突变(C^(44)R、Y^(68)H、F^(86)L、I^(105)V、S^(110)P、D^(116)Y、V^(137)I、R^(154)G、T^(158)I、M^(168)V、F^(175)V、C^(203)Y、S^(221)G、R^(232)C、P^(238)S、C^(262)S、S^(266)R、S^(278)P、T^(282)A、M^(295)V)。重组分析结果显示,GZAS2020株VP4基因和NSP4基因存在重组事件,是由KT727244.1株和MK227934.1株的VP4基因、MK228074.1株和AF144797.1株的NSP4基因重组形成的重组病毒。综上所述,GZAS2020株是由猪源病毒株重组而来,存在跨种间传播,且有传播给人的风险,应引起高度重视。本研究在贵州首次分离到G5P[13]型PoRV,对其遗传演化特征分析为PoRV感染的防控提供参考依据。