摘要：背景:脂肪间充质干细胞具有多向分化能力,并且相对更加容易获得,因此作为一种新的细胞工程的种子细胞日渐受到重视。目的:观察从大鼠皮下分离脂肪间充质干细胞的体外培养情况,并对其进行免疫细胞化学染色等鉴定。设计:动物实验。单位:解放军总医院心内科。材料:选用1只健康雄性Wistar大鼠,清洁级,鼠龄4个月,体质量200g;Ⅰ型胶原酶、DMEM培养基、特级胎牛血清(GIBCO公司);免抗大鼠CD13、CD34、CD44、105、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF、Myosin等多克隆抗体及SABC试剂盒(武汉博士德公司);绿色荧光蛋白-重组腺病毒包装载体为北京本元正阳基因技术有限公司产品。方法:实验于2006-10在解放军总医院心内科完成。①细胞分离和培养:全麻下取Wistar大鼠腹股沟脂肪垫0.3g,剪碎,消化后培养,镜下观察有大量梭形贴壁细胞后二三天换DMEM培养液,观察细胞生长情况。调整细胞浓度为2×107L-1,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL。从第2天起每日随机取3孔,胰蛋白酶消化细胞,分别用血球计数板在倒置显微镜下计数。②细胞存活率的计算:收集第3至第8代细胞,加入预配好的DMSO冻存液,2～4周后复苏,台盼蓝染色检测细胞存活率。③免疫细胞化学染色及鉴定:以2×107L-1的细胞数接种多孔培养板,24h后行CD13、CD34、CD44、CD45、CD105、Ⅷ、HLA-DR、VWF因子等细胞表面抗体的免疫细胞化学(SABC法)鉴定及油红染色。④多细胞系定向诱导分化及鉴定:用多孔板接种后加含特定诱导因子的培养基进行多系定向诱导分化,并进行油红O脂肪颗粒染色,对成骨诱导组进行碱性磷酸酶组化染色,对成心肌诱导组进行肌浆球蛋白免疫组化染色。⑤转染腺病毒携带的绿色荧光蛋白基:用96孔板接种第4代ADMSC,同时加入Ⅰ型腺病毒为载体的绿色荧光蛋白,以不同MOI值1∶50、1∶100、1∶150、1∶200转染,观察转染情况。主要观察指标:①细胞分离和培养观察结果。②冻存与复苏后细胞存活率。③免疫细胞化学染色及鉴定结果。④多细胞系定向诱导分化及鉴定结果。⑤转染腺病毒携带的绿色荧光蛋白结果。结果:①从0.3g皮下脂肪分离出约3.6×105贴壁细胞,并可在体外多代传代培养扩增。②细胞冻存2～4周后复苏用台盼蓝染色示存活率在90%以上。③各代CD13、CD44、CD105等免疫细胞化学染色均阳性,CD45、Ⅷ因子、HLA-DR、VWF等免疫细胞化学染色均阴性。④从第2代开始,各代均可见少量细胞油红O染色阳性,而且在延长培养基的换液时间后,油红O染色阳性细胞明显增多。体外多系定向诱导分化后油红O染色、碱性磷酸酶染色、肌浆球蛋白免疫组化检测分别阳性。⑤转染72h后荧光显微下观察,在MOI值1∶200见绝大多数细胞发出绿色荧光,转染成功,粗测转染率在90%以上。结论:可以从大鼠皮下脂肪成功分离出大量具有成脂、成骨、成肌等多向分化潜能的间充质干细胞,该细胞可以在体外培养进行多代传代及大量扩增、长期冷冻保存,并且成功转染了Ⅰ型腺病毒为载体的绿色荧光蛋白基因。