摘要：肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 。

摘要：目的 用鸡卵清溶菌酶(Hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换hTNF-α3’末端序列,构建和表达hTNF-α新型免疫抑制剂。方法 将重组的hTNF-α HEL克隆、表达、纯化后进行初步的生物学活性鉴定。结果 DNA测序分析表明,重组的hTNF-α HEL3’末端序列与设计序列完全相同。将其插入pBV220表达载体中,重组菌经42℃诱导4h做SDSPAGE分析,结果显示该免疫抑制剂获得了表达,M_r为17000,其表达量为菌体总蛋白量的30％。Western blot结果证实,该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应。对该表达蛋白进行了阴离子交换柱纯化,获得的重组蛋白的纯度可达95％以上。对该蛋白的体外杀伤活性检测表明,该蛋白已完全丧失了TNF-α的体外杀伤活性。结论 上述实验结果证明,TNF-α免疫抑制剂的构建获得了成功,该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性,为其下一步治疗作用的研究奠定了基础。

摘要：目的 :用鸡卵清溶菌酶 (henegg whitelysozyme ,HEL)T辅助细胞表位序列替换新型rhTNF α3’末端序列 ,构建和表达新型rhTNF α免疫抑制剂。方法 :克隆、表达、纯化和鉴定新型rhTNF α免疫抑制剂。结果 :DNA测序表明 ,重组新型hTNF αHEL的 3’末端序列与设计序列完全相同。将其转移到pBV2 2 0表达载体中 ,重组菌经 42℃诱导后做SDS PAGE分析 ,结果显示该重组体获得了表达 ,其表达量为菌体总蛋白量的 30 %,表达形式为包涵体 ,对该包涵体进行溶解和复性 ,再经阴离子交换柱纯化 ,获得的重组蛋白的纯度可达 90 %以上。免疫印迹鉴定结果证实 ,该表达蛋白可与抗TNF α抗体产生免疫反应。体外杀伤活性检测显示 ,该蛋白已完全丧失了新型TNF α的体外杀伤活性。结论 :上述实验证实 ,新型rhTNF α免疫抑制剂构建成功 ,该免疫抑制剂既保持了与TNF α抗体结合的能力又失去了TNF α的杀伤活性 ,为其下一步治疗作用的研究打下了基础。

摘要：目的　构建单、双及三单位核酶 ,鉴定其体外切割活性及对K5 6 2生物学特性的影响 ,探讨核酶用于基因治疗的前景。方法　首先针对bcr abl融合位点设计并合成 3个单核酶 ,而后通过基因重组构建单、双及三核酶载体 ,以体外切割试验鉴定并比较其活性。然后以脂质体将bcr abl三核酶逆转录病毒载体转入K5 6 2细胞 ,观察其对K5 6 2细胞周期、凋亡、超微结构的影响。结果　构建成功bcr abl特异性系列核酶共 6个重组载体 ,切割试验证实系列核酶载体中三核酶体外切割活性最强 ,为 70 8% ,双核酶次之 ,分别为 6 0 7%和 30 3% ,不同位点的单核酶切割活性分别为 5 4 6 %、2 5 3%和3 6 %。bcr abl特异性多核酶通过诱导凋亡抑制K5 6 2细胞增殖。结论　bcr abl特异性核酶在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的应用前景 ,为多核酶体外净化骨髓联合自体骨髓移植治疗提供了理论和实验依据。

摘要：目的:在大肠杆菌中克隆表达猪重组生长抑素基因,并进行纯化和鉴定.方法:根据GenBank公布的猪生长抑素基因序列,按照大肠杆菌偏爱密码子设计并合成2条DNA单链,退火后获得猪生长抑素基因序列.克隆至原核表达载体pGEX-4T-1质粒中,转化感受态细胞DH5α,经IPTG诱导表达重组融合蛋白并用GST亲和柱对其进行纯化.结果:重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定证明基因完全正确,经IPTG诱导后在大肠杆菌DH5α中得到高水平表达,表达产物经超声和溶菌酶破碎和Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化获得重组蛋白.结论:猪生长抑素基因得到了高水平表达,纯化后纯度达到95%以上,为表达产物的大量制备、重组疫苗的进一步优化及在畜牧业生产上的应用研究奠定了基础.

摘要：目的　克隆和表达 EPO模拟肽基因 4串联体 .方法　设计了特殊的基因串联方案 ,在人工合成 EPO模拟肽全基因的基础上 ,将 EPO模拟肽基因由单体逐步地连接成 4串联体 .继而将获得的正确 EPO模拟肽 4串联体插入 p BV2 2 0表达载体诱导表达 .结果　构建的 EPO模拟肽基因 4串联体经酶切和 DNA测序分析 ,结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同 .EPO模拟肽 4串联体插入 p BV2 2 0载体后 ,重组菌经 42℃诱导 4h,SDS- PAGE分析结果显示 ,该串联体得到较高水平的表达 .凝胶扫描结果表明 ,其表达量约占菌体蛋白总量的 2 0 % .结论　 EPO模拟肽基因

摘要：目的　探讨多单位核酶体外净化慢性粒细胞白血病 (慢粒 )骨髓的可能性 ,研究多单位核酶的体外切割活性及对慢粒细胞恶性表型的逆转作用。方法　针对慢粒发病中起重要作用的bcr abl融合基因 ,在融合位点两侧 4 4碱基范围内设计、合成 3个核酶 ,其中 2个切割位点位于bcr基因 ,1个位于abl基因。通过基因重组构建多单位核酶体外转录载体及逆转录病毒表达载体 ,鉴定其体外切割活性。将多单位核酶逆转录病毒表达载体转染K5 6 2细胞 ,应用MTT、3 H TdR掺入、RT PCR、斑点杂交、流式细胞仪、透射及扫描电镜等方法 ,检测多单位核酶对慢粒细胞增殖活性及细胞超微结构、细胞周期、凋亡等的影响。结果　多单位核酶的体外切割活性为 70 .8% ,逆转录病毒载体转染慢粒K5 6 2细胞系后 ,细胞DNA合成及细胞增殖受到明显抑制 ,转染后 96h抑制率达 5 0 %左右。多单位核酶转染细胞后能够有效切割细胞RNA ,使转染细胞RNA减少 10 0 0倍左右。流式细胞仪检测显示多单位核酶转染 72h后 ,18.4 %的细胞发生凋亡 ,大多数细胞被阻滞于G期 ,分裂期 (S期 )细胞数减少约 4 1.9%。透射、扫描电镜见转染细胞出现核固缩、凋亡小体等细胞凋亡的特异性表现。结论　多单位核酶不仅具有较高的体外切割活性 ,而且其逆转录病毒载体能够有效转染慢?

摘要：目的　通过改变部分翻译起始区序列观察对 EPO模拟肽基因 8串联体表达的影响 .方法　设计和人工合成了部分翻译起始区域 (translation initiation region,TIR) DNA序列 ,将该序列插入 p BSEPOM8(含 EPO模拟肽基因 8串联体序列 )的 Eco RI和 X ba I位点 ,经 DNA测序确定正确重组质粒 ,再将 EPO模拟肽基因 8串联体 (含改建的翻译起始区域 )克隆到 p BV2 2 0载体的 Eco RI和 Bam HI位点 ,诱导表达 .结果　 DNA测序证明 ,人工合成的 DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因 8串联体的翻译起始区域 .该串联体基因插入 p BV2 2 0载体后 ,经 42℃诱导 ,在细菌裂解上清中出现一条相对分子质量为 2 2× 10 3(Mr)的新蛋白带 ,与 EPO模拟肽基因 8串联体的理论计算分子量相符合 .经薄层扫描证明该蛋白带约占细菌蛋白总量的 15 % .结论　通过改变部分翻译起始区域起动了 EPO模拟肽基因 8串联体的翻译 ,使原来不表达的 EPO模拟肽基因

摘要：本文拟针对在慢性粒细胞白血病发病中起关键作用的ｂｃｒａｂｌ 融合基因， 构建特异性的系列核酶载体。为此，我们针对ｂｃｒａｂｌ 融合位点设计、合成了３ 个相邻的锤头状核酶。通过基因重组将３ 个单核酶按顺序定向克隆入改建的ｐＧＥＭ３ｚｆ 载体中，构建了ｂｃｒａｂｌ 单核酶、双核酶及三核酶体外转录载体， 并在此基础上将三单位核酶克隆入ｐ ＤｏＲｎｅｏ 载体中构建三核酶逆转录病毒载体。此外， 通过ＰＣＲ 方法， 扩增了ｂｃｒａｂｌ 融合位点附近约３７６ｂｐ 的序列，成功地构建了ｂｃｒａｂｌ 融合基因体外转录载体。本文构建的ｂｃｒａｂｌ 特异性系列载体，为今后遴选特异、高效的核酶打下了基础，并为将核酶用于自体骨髓移植的体外骨髓净化创造了条件。

摘要：以pBVTNF为起始质粒 ,设计合成了 2个DNA片段 :一个含有起始码、TNF起始码后的 2个氨基酸序列和 6个组氨酸序列 ;另一个含有Thrombin和hydroxylamine裂解位点序列。将上述 2个合成DNA片段分别与pBVTNF载体重组 ,获得了一个通用的TNFHis表达载体。在该表达载体中 ,含有 6×His的纯化标签和Thrombin和hydroxylamine融合蛋白裂解位点。分别将IFN IL 11和TNF基因插入该表达载体的多克隆位点 ,42℃诱导表达后 ,经SDS PAGE分析 ,结果表明 ,所有插入基因都获得了较高水平的表达。薄层扫描结果证实 ,所有融合表达蛋白的表达量均占菌体总蛋白的 2 0 %以上。Westernblot检测显示 ,所有融合表达蛋白均可与抗TNF α单抗发生免疫反应 ,间接证明融合蛋白均获得了表达。TNFHisTNF和TNFHisIFN在温度诱导表达后 ,菌体裂解液经Ni NTAAgaroseBeads亲和柱纯化 ,纯化结果表明 ,TNFHis中的 6×His序列可与Ni NTAAgaroseBeads结合。