摘要：目的寄生虫感染与癌症的关系已成为研究热点之一。目前胃肠癌患者肠道单一原虫感染已有报道,但共感染报道较少见。本研究旨在明确胃肠癌患者肠道原虫共感染情况。方法根据人五毛滴虫、十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、人芽囊原虫、脆弱双核阿米巴和毕氏肠微孢子虫特异的基因序列设计引物进行巢氏PCR扩增,检测195例临床胃肠癌患者肠道原虫共感染情况。结果巢氏PCR检测结果显示胃肠癌患者肠道原虫总感染率为48.72%(95/195)。其中2种原虫共感染23例(8例:人五毛滴虫+人芽囊原虫;11例:人五毛滴虫+微小隐孢子虫;3例:人五毛滴虫+十二指肠贾第虫;1例:十二指肠贾第虫+微小隐孢子虫),占肠道原虫感染的24.21%。3种原虫共感染为3例(1例:人五毛滴虫+微小隐孢子虫+人芽囊原虫;2例:人五毛滴虫+十二指肠贾第虫+微小隐孢子虫),占原虫感染的3.16%。1种原虫感染67例(56例:人五毛滴虫;9例:微小隐孢子虫;1例:人芽囊原虫;1例:脆弱双核阿米巴),占原虫感染的70.52%,未检测到毕氏肠微孢子虫感染。结论胃肠癌患者存在肠道原虫共感染且感染率较高。单因素方差分析发现人五毛滴虫单独感染病例显著高于含人五毛滴虫的2种原虫共感染(P=0.0022)以及3种原虫共感染病例(P=0.0019),而2种和3种原虫共感染病例的感染率间无明显差异(P=0.2775),表明胃肠道癌症患者中人五毛滴虫单独感染病例高于2种或以上原虫共感染病例。BLAST和单核苷酸多态性分析发现,不同感染原虫的基因序列除个别与GenBank参考序列同源性为100%外,其他基因序列在不同位点出现不同程度的碱基突变、插入或丢失现象。该研究结果为今后胃肠癌患者病因学以及诊断和防治提供了重要参考。

摘要：目的对微小隐孢子虫热休克蛋白Hsp90蛋白进行原核表达与鉴定。方法根据微小隐孢子虫Hsp90基因的CDS区设计引物,PCR扩增长度为2136 bp的Hsp90基因片段,然后将其连接至pET-32a(-)载体,构建重组质粒PET-32a-Hsp90。将重组质粒转化入BL21感受态,使用0.1 mmol/L IPTG诱导重组Hsp90蛋白的表达并进行SDSPAGE分析;采用His标签蛋白填料纯化柱对表达产物进行纯化,采用Western blot鉴定重组蛋白Hsp90的反应原性。结果PCR扩增微小隐孢子虫Hsp90基因片段大小为2136 bp,测序表明扩增基因片段大小正确并成功与PET-32a(-)连接。将PET-32a-Hsp90转化入BL21感受态,经IPTG诱导表达分子质量约为78.32 ku的重组Hsp90蛋白,Western blot检测该蛋白能被Anti-His标签抗体识别。结论成功构建PET-32a-Hsp90重组质粒,并通过原核表达系统成功表达具有反应原性的重组Hsp90蛋白,为该蛋白的功能研究奠定了基础。

摘要：【目的】建立一种快速、准确、灵敏的微小隐孢子虫可视化检测方法。【方法】本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与CRISPR/Cas12a系统相结合,通过荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果。针对微小隐孢子虫的小亚基核糖体RNA(small subunit ribosome RNA,SSU rRNA)基因设计和筛选crRNA和RPA引物,利用两种不同的单链DNA报告分子以荧光数值和侧流层析试纸条呈现检测结果。通过检测微小隐孢子虫和7个其他病原体评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性。通过梯度稀释的重组质粒和微小隐孢子虫基因组评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的敏感性,并将该方法应用于临床样本的检测。【结果】本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法可在90 min内完成对样本中微小隐孢子虫的检测,与大肠杆菌、十二指肠贾第虫、华支睾吸虫、弓形虫、肝片吸虫、人五毛滴虫、沙门菌均无交叉反应,可特异性检测出微小隐孢子虫;敏感性试验结果显示,该方法的最低检测限为10个卵囊/mL。利用此方法对70份牛粪便样本和50份人粪便样本进行检测,经荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果,微小隐孢子虫的阳性率分别为15.7%(11/70)和6.0%(3/50),与套式PCR检测结果完全一致。【结论】本研究建立的微小隐孢子虫RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法具有高特异性和高灵敏度,且检测结果直观,不依赖昂贵的仪器设备,在微小隐孢子虫的现场检测和风险监测方面具有广阔的应用价值。

摘要：本研究根据GenBank牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因设计1对引物,利用全血基因组DNA提取试剂盒提取牛瑟氏泰勒虫全血基因组DNA,PCR扩增得到了大小为786 bp的基因片断,测序分析证明,它与已报道序列的核苷酸同源性可达99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,经酶切和PCR鉴定,证明成功构建了含有目的基因片段的重组表达载体pET-28a-P33。将此质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因在大肠杆菌中用IPTG诱导4 h时表达量达到高峰,表达产物为分子质量约30.3 ku的融合蛋白,其表达量占菌体总蛋白的43%,以包涵体形式存在;Western blotting试验证明,表达蛋白P33可被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性。

摘要：从中国人源蓝氏贾第虫北京株 ( BEIJ88/ BTMR1/ 1)体外纯培养的电镜负染和超薄切片观察到蓝氏贾第虫病毒粒子。该病毒位于感染早期贾第虫的细胞质中 ,感染晚期的细胞核中。根据国外发表的蓝氏贾第虫病毒序列设计了 6对互相重叠的引物。用这 6对引物对从中国人源蓝氏贾第虫北京株发现的蓝氏贾第虫病毒基因组进行 RT- PCR,将产物连接到 p MD18- T载体中并转化入 DH5 α感受态菌 ,送上海生工测序 ,通过 BL AST对 Gen- Bank进行同源性搜索。结果测得我国人源蓝氏贾第虫病毒基因组全长为 6 2 73bp,与国外报道的蓝氏贾第虫病毒序列同源性为 95 % ,编码的氨基酸同源性为 90 %。

摘要：根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。

摘要：本实验对自行设计的抗疲劳功能性食品复方添加剂的作用机理进行了初步研究。结果表明 ,该添加剂可显著提高小鼠运动后糖原含量 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ,增强血清LDH、全血SOD和GSH -PX 活性 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ,降低血清MDA、BUN和血乳酸含量 (P <0 .0 5或P <0 .0 1) ,提高小鼠胸腺指数和脾脏指数 (P <0 .0 5或P<0 .0 1)。据此分析认为 ,该添加剂可通过增强机体抗氧化能力 ,减少运动中糖原消耗、体蛋白动员和代谢产物积累发挥抗疲劳作用 。

摘要：目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化入大肠杆菌*** BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础。方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质粒PET-28a-GRA1,转化*** BL21,IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:克隆的GRA1基因与GenBank收录的基因序列同源性为100%。对重组质粒进行酶切和PCR鉴定,获得573bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-GRA1。SDS-PAGE电泳分析表明重组蛋白条带的相对分子质量约为24 000,Western blotting显示重组蛋白能被鼠抗弓形虫血清识别。结论:成功获取GRA1基因,构建了PET-28a-GRA1重组质粒并获得了高效表达。

摘要：从长春地区鸭的粪便中分离纯化了火鸡隐孢子虫 (Cryptosporidiummeleagridis )卵囊 ,根据隐孢子虫 18SrDNA基因序列设计合成引物 ,用PCR扩增了卵囊基因组DNA大小 5 86bp的片段 ,PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化 ,纯化后PCR产物直接测序。将测得的序列用Dnastar软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较 ,并绘制了系统发育进化树。结果初步建立了火鸡隐孢子虫的PCR检测方法 ,序列分析显示长春鸭源火鸡隐孢子虫与国外 9株隐孢子虫相应序列同源性在 82 7%～ 99.8%之间 ,其中与国外火鸡源火鸡隐孢子虫相应序列同源性为 85 .3% ;与C .felis同源性最低 ,与C .muris同源性最高。

摘要：目的对阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因的克隆,以便探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板,根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TVV-T1序列设计一对引物,经RT-PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物,将其克隆到pMD-18T载体后测序,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析。结果目的基因片段长度为2271bp,与阴道毛滴虫病毒T1株(U08999)的同源性最高为85.2%。结论国内首次成功克隆出阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因序列。