摘要：根据水疱性口炎病毒印第安那型(IND型)和新泽西型(NJ型)G蛋白抗原表位分布图,在表达抗原表位较密集的基因区域设计引物,采用RT-PCR方法分别扩增水泡性口炎病毒IND型657 bp G蛋白基因片段和NJ型666 bp G蛋白基因片段,并将其克隆到pET-32a表达载体。将重组质粒转化宿主菌Rosetta,经1.0 mmol/L IPTG诱导,外源基因获高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明截短表达的2个血清型的重组G蛋白与标准阳性血清发生反应。将2个血清型的重组G蛋白等量混合作为检测抗原包被酶标板,建立了可检测IND型和NJ型水泡性口炎病毒抗体的间接ELISA方法。

摘要：根据猪繁殖与咱呼吸综合征病毒JX株编码N蛋白的ORF7基因序列设计特异性引物。采用RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段(367 bp),将其克隆于表达载体pET-32a上。测序验证后将重组质粒pET-32a-JX-N转入宿主菌Rosetta,经0.7 mmol/L IPTG诱导,SDS-PAGE显示外源基因编码的重组N蛋白在宿主菌中表达效率较高。Western-Blot试验结果显示,重组N蛋白具有反应原性。将纯化的重组N蛋白包被酶标板,建立并优化了能够用于PRRSV抗体检测的间接ELISA方法。

摘要：为建立同时检测口蹄疫病毒(FMDV)和牛肠道病毒(BEV)的双重RT-PCR方法,本研究根据已发表的FMDV和BEV基因的5'UTR保守区域,分别设计、筛选出一对特异性引物建立了双重RT-PCR方法,并优化了反应体系和条件。采用该方法检测其他几种牛相关病毒结果均为阴性,表明特异性良好。该方法对FMDV的最低检出限为8 TCID50/0.1 mL,对BEV的最低检出限为2 TCID50/0.1 mL,表明其具有良好的敏感性。采用该方法检测了852份临床样品,并与病毒分离方法比较,结果两种方法检测结果完全一致。本研究首次建立了同时检测FMDV和BEV的双重RT-PCR快速检测方法,该方法的建立为FMDV和BEV的检测提供了一种技术手段。

摘要：为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5'UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化。该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1 mL,敏感性比病毒分离法高10倍。而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应。用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1%,表明该方法具有良好的重复性。采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致。因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持。本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染。

摘要：在对设计合成的引物和6-carboxy-fluorescein(6-FAM)荧光素标记的TaqMan水解探针进行筛选的基础上,通过反应体系优化,建立了检测猪链球菌通用和2型的2种荧光PCR检测技术,实现了对猪链球菌的快速检测和定型。敏感性、特异性、重复性、感染组织模拟试验及临床样品的检测结果均表明建立的方法快速、特异、灵敏,整个检测过程(包括样品的前处理时间)可在1.5 h内完成,检测培养物和模拟组织样品的灵敏度可达10 CFU～100 CFU。

摘要：参考禽流感病毒(AIV)基质蛋白(M)基因设计了两对引物,特异性识别其6个不同位点,建立了基于颜色判定的环介导等温扩增反应(LAMP)方法。试验对不同禽源病毒进行了测试,结果发现该方法仅特异性地检出禽流感病毒(H9和H5亚型)核酸,对AIV病毒的检测极限为10 EID50。人工感染病料检测结果与鸡胚病毒分离法的符合率为96.7%。数据表明,建立的LAMP方法特异、敏感、简便,在禽流感的诊断中具有很大的临床应用潜力。

摘要：根据2005年从北京某牛场分离得到的一株牛肠道病毒2型(BEV-2)毒株序列,设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增BEV-2包含VP1(840 bp)蛋白基因片段的VP1+(1 275 bp)序列,扩增产物克隆到p MD-T19,进行测序验证。验证该序列为目的片段后,将其克隆到表达载体p ET-32a。重组质粒转化至Rosetta,经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示重组蛋白在大肠杆菌中高效表达。将重组蛋白作检测抗原包被酶标板,成功建立了检测牛肠道病毒2型抗体的间接ELISA方法。上述工作,为下一步BEV-2单克隆抗体的制备打下了基础。

摘要：采用TaqMan方法,在对人、禽、猪以及马流感病毒代表株HA序列多重比对基础上,设计合成动物流感病毒H1亚型和H3亚型的兼并引物和LNA和MGB修饰短探针,经反应条件优化,建立了针对流感病毒H1亚型及H3亚型的双重实时RT-PCR检测方法。应用建立的方法分别对人、禽、猪以及马流感病毒核酸进行检测,结果显示,建立的方法通用性良好,可有效检测和鉴别H1和H3亚型流感病毒,但对其他亚型的流感病毒以及新城疫病毒核酸检测结果为阴性,表明建立的方法特异性强。进一步经体外转录制备了猪流感病毒H1和H3亚型HA完成编码区的核酸标准品cRNA,经稀释、分装、定量、均匀性和稳定性检验后,作为方法的质控品对建立的方法进行评价,结果表明,所建立的双重短探针实时RT-PCR方法灵敏度可达2.0×102拷贝/反应。在对586份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足动物流感病毒H1/H3亚型的早期快速检测的需求。

摘要：利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析,选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针,并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上,建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料,而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果,证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×10^1拷贝/反应,相比于巢式RT-PCR方法,其灵敏度高10-100倍以上。在对54份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。

摘要：从禽流感病毒A/Chicken/1/2002(H7N1)核酸中扩增了完整HA的基因编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备c RNA。用RNA保存液稀释至含量约108Copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过8家实验室联合定值,取平均值作为定值结果;经统计分析计算了该标准品的不确定度。此外,采用Taq Man方法,根据禽流感病毒H7亚型的血凝素基因的末端,采用1对引物和2条MGB探针,建立了禽流感病毒H7亚型Taq Man荧光RT-PCR快速检测技术。应用建立的方法对研制的标准品进行检测,检测限可达10基因拷贝;对新城疫病毒及其他亚型的流感病毒核酸进行检测,结果表明,建立的方法特异性良好,而且双探针的设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。