摘要：目的 借助酵母的免疫特性,设计一种新型抗乙型肝炎病毒(HBV)治疗性疫苗,探索一种全新的可有效活化机体抗病毒免疫应答方式。方法 以基因工程技术构建内含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白(HSP)70(1～370)-HBsAg的重组毕赤酵母,皮下免疫BALB/C小鼠,检测小鼠对HBsAg的体液及细胞免疫反应。结果 重组酵母成功诱导了小鼠体内表面抗体的产生,显示其抗原性并未受到影响。细胞免疫检测未能获得预期的结果。结论 整体重组酵母活菌具有疫苗特性,整体重组酵母用于抗HBV治疗是一个新的思路,未能检测到细胞免疫反应可能与重组酵母的用量、注射方式等有关。

摘要：目的观察姜黄素衍生物对实验性非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的治疗作用。方法60只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、等渗盐水对照组（等渗盐水组）、姜黄素灌胃组（姜黄素组）、姜黄素衍生物静脉注射组（衍生物组），每组12只。通过高脂饲料结合四氯化碳的复合方式建立大鼠NASH模型。造模后分别给予姜黄衍生物尾静脉注射及姜黄素灌胃治疗（剂量50mg／kg），等渗盐水作为对照。治疗结束后取血及肝组织，计算肝指数，进行血脂和肝功能指标检测及病理组织学检查。RT-PCR法检测肝组织中肿瘤坏死因子α（TNFα、核转录因子κB（NF-κB）、羟甲戊二单酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶的mRNA转录水平，Westernblot检测TNFa及NF-KB的蛋白质表达水平。多组计量资料比较采用成组设计的方差分析、Kruskal-WallisH检验，两两比较采用LSD法、成组设计的Wilcoxon秩和检验，P〈0．05为差异有统计学意义。结果与等渗盐水组比较，衍生物组大鼠血清ALT、AST和总胆固醇水平明显下降[分别为（69．20±27．58）U／L对比（102．43±47．29）U／L、（i58．00±39．15）U／L对比（229．50±105．20）U／L和（2．08±0．30）mmol／L对比（2．58±1．02）mmol／L，P值均〈0．05]；肝组织纤维化程度（s）显著改善（0．67±0．52对比2．50±0．40，P〈0．05）；TNFα、NF-κB及HMG-CoA还原酶的mRNA表达明显下调（P值均〈0．05），TNFα和NF-κB的蛋白质表达也明显下调（P值均〈0．05）。相对于姜黄素组，衍生物组大鼠肝指数及血清ALT、AST明显下降[分别为4．88％±0．62％对比5．16％±0．61％、（69．20±27．58）U／L对比（82．5±33．23）U／L和（158．00±39．15）U／L对比（211．75±106．30）U／L，P值均〈0．05】；肝组织脂肪变（F）及炎症（G）程度明显减轻（分别为1．17±0．41对比2．20±1．10和I．50±0．55对比2．40±0．58，P值均〈0．05）；TNFα、NF-κB和HMG-CoA还原酶的mRNA表达显著下调（P值均〈0．05）。结论相对于传统的姜黄素，水溶性姜黄素衍生物明显延缓实验性脂肪肝大鼠的纤维化进程，改善脂质代谢。

摘要：构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P<0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。

摘要：本研究旨在借助毕赤酵母的表达和免疫特点,设计一种新型抗HBV治疗性疫苗,探索一种全新的可有效活化机体抗乙型肝炎病毒细胞免疫应答的方式。

摘要：目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。