摘要：目的:基于仿生学原理设计、合成具备黏附性能的阴、阳离子肽,并分析其混合后对黏附力的影响,为新型仿生黏附材料研制奠定基础。方法:分析贻贝足蛋白5(mussel foot protein 5,Mfp5)和沙堡蠕虫分泌蛋白3(cement precursor protein of the Phragmatopoma californica 3,Pc3)的结构特点,理性设计出黏附性能较好的阴、阳离子肽。通过拉力强度试验机、原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)及石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,QCM)等对其黏附力和吸附量等参数进行检测,并从多肽组成和相互作用等方面分析其黏附机制。结果:阴、阳离子肽通过多肽固相合成法合成,纯度达到95%以上。拉力测试表明阴、阳离子肽的黏附力随固化时间增加而增大,最高分别达到174.04 kPa及180.11 kPa,并且两者混合后黏附力显著增强,等比例混合后高达347.81 kPa;QCM检测表明阳离子肽、阴阳离子肽混合物对金(aurum,Au)表面的吸附量可分别达到82.67 ng/cm^(2)和151.53 ng/cm^(2);AFM检测阴、阳离子肽的平均微观黏附力分别为5.43 nN及4.95 nN,且两者等比例混合后可提高至18.54 nN。结论:基于贻贝和沙堡蠕虫构建的阴、阳离子肽具备良好的黏附性能,且其黏附力可通过静电力介导的复合凝聚显著提高,该结果为新型仿生黏附材料研制提供了依据。

摘要：目的构建基于贻贝足蛋白(Mfp)和沙堡蠕虫分泌蛋白(Pcs)的融合基因,并实现其在昆虫细胞中的表达,为新型黏附材料研制奠定基础。方法理性设计基于Mfp和Pcs的融合分子,通过PCR扩增得到目的基因,再通过pFastBacHBM载体所介导的平末端克隆以及DH10Bac所介导的转座合成带有目的基因的重组杆状病毒质粒(Bacmid DNA),利用昆虫表达系统生成携带目的基因的杆状病毒,并通过病毒感染细胞实现融合蛋白Pc1⁃Mfp5的可溶性表达。结果测序结果显示,重组载体构建成功。病毒滴度测试显示,收获高滴度的杆状病毒。SDS⁃PAGE以及Western印迹分析表明,Pc1⁃Mfp5融合蛋白在昆虫细胞中实现了可溶性表达。结论成功构建pc1⁃mfp5融合基因,并实现了其在昆虫系统中的可溶性表达,为新型仿生黏附材料的研制奠定了基础。

摘要：目的建立一种快速、准确、可视化、易开展的B、E型腺病毒检测技术。方法针对B、E型腺病毒壳蛋白保守序列设计通用引物,建立可同时检测出这两种腺病毒型别的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA)检测技术,评价其灵敏度与特异性,并验证最佳反应温度与反应时间,同时利用该法对19例B、E型腺病毒感染患者及10例健康志愿者鼻咽拭子标本进行检测。结果腺病毒LFD-RPA法检测灵敏度可达10拷贝/μl,与q PCR方法相近,且不会与其他亚属腺病毒及其他病毒发生交叉反应。反应可在25~45℃温度范围内高效进行,检测全程仅需15~20 min。利用临床咽拭子标本对检测体系进行评估,其灵敏度及特异性均达100%。结论该检测方法灵敏度高、特异性强、操作简单,反应快速,能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖,在基层卫生部门,尤其在野外及现场检测中具有极大的应用潜力。

摘要：目的环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型等温核酸扩增方法。由于其具有简便、高效、特异性高和成本低等优点,在甲型H1N1流感和肺结核等流行病检测中得到了广泛应用。在LAMP技术中,关键的起始步骤是设计合适的引物序列。为了让引物设计更加方便与高效,我们开发了LAMP引物设计软件BioSunLAMP。方法采用Delphi程序设计语言开发了界面友好、便于使用的软件系统。结果经甲型H1N1流感、结核分枝杆菌实验验证,BioSunLAMP软件设计的引物达到了预期效果。此外,与同类软件相比,BioSunLAMP还具有如下特点:①集引物设计与引物特异性分析于一体,可以通过本地数据库或远程调用NCBI的相关数据库来检查引物特异性;②支持针对多序列的通用引物与特异引物设计。结论 BioSunLAMP软件的开发,为LAMP技术的普及提供了很好的生物信息学支持。

摘要：目的建立一种方便、快速且灵敏度高、特异性强的日本血吸虫(SJ)感染性钉螺检测方法。方法 PCR扩增SJ基因片段,并将其克隆到T载体构建阳性参照物;建立SJ核酸恒温扩增反应体系,并通过检测经等比稀释的阳性参照物和相关样本基因组DNA分析其灵敏度和特异性;设计相应的核酸纯化方法,组装SJ感染性钉螺检测试剂,并通过检测钉螺样本对其进行验证。结果获得长度213 bp的PCR扩增产物,并用该扩增产物构建了重组T载体,即阳性参照物;建立了SJ核酸恒温扩增反应体系,该体系可根据颜色变化判定扩增结果,且灵敏度和特异性良好;组装了SJ感染性钉螺检测试剂,该试剂可检测出含1%阳性钉螺的钉螺样本。结论成功建立了一种可视化的SJ感染性钉螺检测方法,并通过应用对其进行了验证。

摘要：目的:以硫氧还蛋白(Trx)为骨架,pB ridge为载体,构建可诱导表达的酵母构象型随机10肽库。方法:利用PCR扩增出trx基因,向trx的突环区引入AscⅠ酶切位点,构建pB ridge-mTrx重组载体。采用(NNK)10的编码方式设计并合成两条寡核苷酸链,经退火、延伸,AscⅠ,RsrⅡ双酶切后,克隆至pB ridge-mTrx载体,电转化***10B感受态细胞。对所构建多肽文库的库容和随机性进行了鉴定,并利用W estern印迹对文库的可诱导性进行分析。结果:获得库容量为8.7×108的随机肽库。随机挑选20个克隆进行测序,4个核苷酸的出现频率与理论值接近。在M et缺陷培养基中,随机肽库可被诱导表达。结论:成功构建可诱导表达的随机肽库,为进一步筛选特异性多肽奠定了基础。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9技术构建RIP1稳定敲除的人永生化表皮细胞HaCaT细胞株,在此基础上对RIP1功能进行探究。方法针对GenBank中RIP1基因序列,设计靶向RIP1不同外显子的小指导RNA(sgRNA),并将其克隆至SpCas9-2A-Puro V2.0(PX459)载体中,获得PX459-sgRNA基因敲除载体。将上述载体转染HaCaT细胞并通过嘌罗霉素筛选获得阳性克隆,免疫印迹和DNA测序技术进一步鉴定RIP1敲除效果最佳的单克隆。通过CCK-8实验检测RIP1缺失对细胞增殖能力的影响。分别用TNF-α处理HaCaT^(WT)细胞和HaCaT^(R1P1KO)细胞,流式细胞仪检测敲除RIP1对TNF-α诱导细胞死亡的影响,进一步通过胱天蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK判断细胞死亡类型。结果与结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建RIP1完全敲除的细胞模型,功能分析发现敲除RIP1导致细胞增殖能力减慢;HaCaT^(R1P1KO)对TNF-α诱导的死亡畀常敏感,这种死亡能被Z-VAD-FMK显著抑制,证明为caspase依赖性细胞凋亡。该研究为探究RIP1在皮肤损伤中的作用奠定了基础。

摘要：通过一些典型应用实例介绍分子生物学实验中计算机辅助设计的概况,例如:使用GOLDKEY软件分别计算蓖麻毒素A链蛋白基因在pBV220载体中的5′和3′端部分RNA二级结构自由能和密码子使用偏性指数等参数,并按外源基因高效表达判别函数,指导基因突变,以构建高效表达载体。按判别函数对原始序列推断为低效表达,实验表明,未能获得表达产物。

摘要：目的对胆管癌相关基因FXYD6基因的功能区进行克隆和表达,以便进一步展开该基因功能研究。方法借助生物信息学方法分析FXYD6基因,设计FXYD6基因信号肽剪切后功能区蛋白体外表达序列,并将其克隆到pBV220表达载体上,继而以大肠埃希菌为表达系统,使功能区蛋白(不含信号肽)获得体外表达。结果该基因主要功能位点位于18～95 aa。PCR扩增出剪切掉信号肽序列的功能区序列(即包含18～95 aa的肽链段),并成功构建pBV220/FXYD6-ex基因功能区重组表达质粒克隆,其在大肠埃希菌DH5α中表达量最高,表达产物主要以包涵体形式存在。结论获得胆管癌相关FXYD6基因融合蛋白表达产物,为后续研究打下基础。

摘要：目的研究北京地区儿童ORMDL3基因表达水平、生活方式、室内空气质量与哮喘发生的相关性。方法采用病例-对照方法进行实验设计。使用RT-PCR法检测儿童ORMDL3基因表达水平;通过《国际儿童哮喘及过敏研究(ISSAC)问卷》收集儿童生活方式信息;并根据《室内空气质量标准(GB/T18883-2002)》中规定的检验方法对室内空气中PM2.5,VOCs,甲醛浓度及空气温湿度进行监测。使用t检验、卡方检验分析病例组与对照组儿童ORMDL3基因表达水平,生活方式与室内空气质量差异;使用Logistic逐步回归来分析ORMDL3基因表达水平,生活方式与室内空气质量对与哮喘之间相关性。结果 ORMDL3基因表达水平在病例组与对照组中有显著差异(P<0.05)。在早发型哮喘患儿中,ORMDL3基因表达水平、哮喘家族史与哮喘显著相关(P<0.05)。而在迟发型哮喘患儿中,ORMDL3基因表达水平、采暖方式、室内空气湿度与哮喘显著相关(P<0.05)。结论 ORMDL3基因表达水平与儿童哮喘的发生密切相关,早发型哮喘患儿与遗传因素有显著关联,而迟发型哮喘患儿中遗传因素与环境因素均与哮喘相关。