摘要：为研究RNA干涉对H5N1亚型禽流感病毒的增殖抑制作用,针对H5N1亚型禽流感病毒的NP和PA基因,设计4对siRNA干涉序列,并将其转染到鸡胚成纤维细胞,6h后接种H5N1亚型禽流感病毒液,在病毒感染后的16～56h内测定细胞上清中的病毒血凝价及观察细胞病变,并在病毒感染36h后检测NP、PA、HA和β-actin基因的mRNA水平。结果显示4对siRNA均能不同程度地抑制H5N1亚型禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞中的增殖,但以PA为靶基因设计的一对干涉序列效果最优;实验还证实随着时间的延长,干涉效应逐渐减弱。本实验为研究RNA干涉技术防控禽流感提供了依据。

摘要：为研制新型H7N9亚型禽流感病毒快速检测试剂盒,根据GenBank中公布的新型H7N9亚型(2013年)禽流感病毒血凝素抗原(HA)和神经氨酸酶抗原(NA)的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于TaqMan探针的多重荧光RT-PCR快速检测新型H7N9亚型禽流感病毒方法。实验结果表明,该方法灵敏度高、特异性好,能够检测到最低浓度为10拷贝/μL数量级的阳性标准品,不但能够将禽流感病毒H7亚型与H1、H3、H5、H6和H9亚型区分开,而且可将新型N9亚型禽流感病毒与原有的N9亚型区分开。采用该方法对珠海市2 700份样品的检测结果与预期结果一致,证实该方法具有较好的推广应用前景。

摘要：为了建立可同时检测H5亚型禽流感病毒、狂犬病病毒、猪链球菌2型、炭疽芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的基因芯片检测方法,本实验根据GenBank中上述6种病原的基因序列,设计并合成了特异性的引物和探针。采用点样法制备杂交芯片,将上述病原扩增产物混合后与芯片杂交。杂交结果显示,针对本试验中6种人兽共患传染病所设计的寡核苷酸探针可特异性识别靶基因,与其他常见病原体之间没有交叉反应。检测的灵敏度在1.38×10-5 pg/μL～151 pg/μL之间。将建立的基因芯片检测方法对临床样品进行检测,结果与荧光PCR方法一致。

摘要：根据GenBank中施马伦贝格病毒S基因的保守区序列,设计1组对应目的片段6个区域的4条特异性引物(包括1对内引物和1对外引物)进行核酸扩增,建立RT-LAMP反应体系并进行反应条件优化,确定最佳内外引物浓度分别为1.2、0.15μmol/L,最佳反应条件为61℃保温60min。特异性和敏感性试验结果表明,本研究建立的施马伦贝格病毒RT-LAMP能检测到133 copies/μL的施马伦贝格病毒克隆质粒。结果表明,该RT-LAMP具有特异性强、灵敏度高和快速简便等优点,是在进出境口岸、养殖场或基层实验室等场所开展快速检测的良好方法。

摘要：针对鲨鱼产品掺杂造假增多而缺乏有效鉴定技术的情况,作者根据Gen Bank中鲨鱼基因的线粒体DNA(mt DNA)序列,使用分子生物学软件Primer Express 2.0设计了一套特异性引物和探针,用来建立Taqman探针荧光PCR检测鲨鱼源性成分的方法。结果表明,对13份已鉴定为鲨鱼鱼翅的样品进行检测,全部出现特异性扩增曲线,阴性对照没有荧光增长。方法特异性强,对市场购买的12份鲨鱼源性样品及9份其他鱼类样品进行检测,12份鲨鱼样品均出现荧光扩增曲线,而非鲨鱼样品均未出现荧光增长;方法灵敏度较高,可检测到的最低质粒拷贝数量级为10拷贝/μL;方法快速准确,操作简便,重复性好,稳定可靠,可应用于市场上鱼翅等常见鲨鱼源性产品的真假鉴定。

摘要：将套式PCR与荧光RT-PCR技术相结合,叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的优势,建立敏感性高于常规荧光RT-PCR的套式荧光RT-PCR检测方法。从GenBank下载禽流感病毒NP基因和HA基因序列,通过比对选取较为保守的片段,设计AIV通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR引物和TaqMan探针;利用体外转录技术制备阳性对照,构建目的片段重组质粒;经反应体系和反应条件的优化,建立套式荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法可特异性地检测禽流感病毒及H5亚型AIV,在30份鱼类养殖水样中检测到19份阳性样品,具有较高的敏感性和良好的特异性;具有高通量、快速的特点,可对大批量样品同时进行检测,试验耗时仅需5h,是自然环境样品中极微量禽流感病毒检测的好方法。

摘要：为了对犀牛源性成分进行有效鉴定,根据犀科(Rhinocerotidae)动物线粒体DNA(mitochondrial DNA)序列,使用分子生物学软件Oligo 7.0设计了特异性引物,用来建立PCR检测犀牛源性成分的方法。结果显示,建立的PCR方法可以对犀牛阳性样品进行扩增,凝胶电泳呈现特异性条带。方法特异性好,13份其他物种的样品均为阴性结果。方法灵敏度较高,可检测到100拷贝重组质粒DNA模板。对5份送检样品检测发现2份犀牛样品,与测序结果一致。结果表明,新建立的方法可应用于样品中犀牛源性成分的检测。

摘要：建立了可同时筛选禽流感病毒(AIV)通用型、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型及鸡新城疫病毒(NDV)、鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的基因芯片检测方法。从GenBank中下载相关序列,利用分子生物学软件设计特异性引物和杂交探针。使用***系统进行芯片点样、杂交、显色、读数,优化反应条件后做灵敏度、特异性试验,然后应用于临床检验。结果显示,各病原间无交叉反应,探针可特异性识别靶基因;病原的最低浓度为4.83pg/μL,灵敏度较高;每个梯度的两个反应结果一致,重复性良好。对临床样品检验,结果同病毒分离鉴定方法一致。本研究建立的基因芯片检测方法可用于禽流感通用型、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型及NDV、EDSV的鉴别检测。

摘要：根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。

摘要：为了建立基于TaqMan探针荧光PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法,本试验参考GenBank已发表的副猪嗜血杆菌(Hemophilus parasuis,HPS)转录起始因子infB基因序列,利用生物学软件Primer Express 2.0设计特异性引物和探针;并对副猪嗜血杆菌标准菌株提取DNA后进行PCR扩增,将产物测序鉴定后克隆到pMD18-T载体,再转化到大肠杆菌感受态细胞,细菌培养后对菌液进行PCR扩增,把产物测序鉴定后获得的重组质粒作为标准阳性对照;最后将建立的TaqMan探针荧光PCR方法进行灵敏度、特异性、稳定性试验。结果显示,该检测方法可以达到1μl 1.0×101拷贝数量级的灵敏度;另外,该方法可以将HPS和大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌分开,特异性良好;稳定性试验显示,2次批内变异系数分别为0.65%和0.92%,批间变异系数为1.31%,稳定性良好。对口岸送检的56份猪肉和12份血浆蛋白粉样品进行检测,结果表明TaqMan探针荧光PCR方法和细菌分离方法的检测效果一致。