摘要：目的 构建敲减死亡相关蛋白激酶1(shDAPK1)基因的慢病毒质粒及稳转神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y),并检测SH-SY5Y细胞中DAPK1敲减后对细胞凋亡的影响。方法 设计并合成特异性敲减DAPK1基因的上下游引物,将引物退火后与双酶切PLKO.1载体经T4连接酶连接、转化、提取质粒并进行DNA测序,获得重组正确的慢病毒干扰质粒pLKO.1-shDAPK1。将该重组的质粒与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞,72 h后收集慢病毒上清液,感染SH-SY5Y细胞,利用嘌呤霉素进行阳性筛选,得到稳定敲减DAPK1的SH-SY5Y细胞系。利用Western blot检测SH-SY5Y稳转细胞系中DAPK1蛋白以及用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)处理后的Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白表达水平,并应用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况。结果 重组pLKO.1-shDAPK1质粒的测序比对结果正确,嘌呤霉素筛选后获得shDAPK1稳转SH-SY5Y细胞系(shDAPK1-SY5Y),该稳转细胞系中DAPK1蛋白表达水平与对照组相比显著下降,此外还上调了Bcl-2蛋白的表达,下调Bax、Caspase-3蛋白的表达且流式检测结果显示该细胞系凋亡发生率明显下降。结论 成功构建了慢病毒敲减质粒pLKO.1-shDAPK1,并建立了DAPK1低表达的SH-SY5Y稳定感染细胞系,明显抑制了细胞凋亡。

摘要：目的构建pEGFP-N1-BRCC3真核表达重组质粒,鉴定并检测其在HEK293细胞中的表达。方法根据去泛素化酶BRCC3(人的同源物称为BRCC36)基因cDNA克隆基因序列和表达载体增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)质粒上的多克隆位点设计引物,利用RT-PCR从小鼠脑组织中提取BRCC3全长基因作为目的DNA片段,选择HindⅢ/SalⅠ内切酶将目的片段与pEGFP-N1真核表达载体进行双酶切,然后用T4连接酶连接,导入大肠杆菌经过转化、抗性筛选、质粒提取等过程获得融合的重组质粒,并再次双酶切电泳后初步筛选出可能正确的重组质粒,进而寄送公司进行DNA测序分析,通过DNAMAN软件比对,鉴定出目的基因BRCC3成功插入pEGFP-N1的重组质粒,以脂质体介导法转染HEK293细胞,通过Western blot检测BRCC3蛋白的表达。结果 DNA测序结果显示,pEGFP-N1-BRCC3重组质粒中目的DNA序列及方向完全正确,开放阅读框正确无误,表明重组pEGFP-N1-BRCC3质粒构建成功,将其转染HEK293细胞后,Western blot检测BRCC3蛋白表达明显增加。结论成功构建了pEGFP-N1-BRCC3真核表达重组质粒,并能在HEK293真核细胞中有效表达,为深入研究BRCC3基因在神经生物学领域的功能提供了实验基础。