摘要：目的探讨慢病毒载体介导短发夹RNA(shRNA,siRNA前体)靶向沉默HOXA10基因对U937细胞增殖、凋亡和形态的影响。方法设计并构建4条针对HOXA10基因的shRNA质粒表达载体,并构建HOXA10基因的过表达质粒,将4条干扰质粒分别和过表达质粒共转染293T细胞,用Western blot检测出敲减效果最好的1条质粒并包装成慢病毒(lenti-shHOXA10);将U937细胞分为干扰组(lenti-shHOXA10)、阴性对照组(lenti-NC)和未处理组,通过流式细胞仪测定慢病毒对U937细胞的感染效率并用real-time PCR、Western blot方法测定对HOXA10基因的沉默作用;瑞氏染色观察3组细胞形态上的变化;MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术检测3组细胞凋亡率。结果成功构建了有效沉默HOXA10基因的慢病毒-shRNA载体。干扰组HOXA10 mRNA的沉默效率为(92.3±1.3)%,蛋白表达水平下降91.1%,干扰组细胞抑制率为(43.9±0.7)%,与阴性对照组、未处理组相比差异有统计学意义(P<0.05);瑞氏染色显示干扰组细胞核质比减小、核分裂相少见;干扰组细胞凋亡率为(27.1±1.4)%,显著高于阴性对照组的(19.4±1.9)%和未处理组的(5.5±1.3)%(P<0.05)。结论慢病毒载体介导的shRNA可稳定地降低HOXA10基因的表达水平,有效抑制U937细胞增殖和促进其凋亡,HOXA10基因有望成为白血病基因治疗的新靶点。

摘要：目的　探讨白血病细胞多药耐药发生的分子机理,寻找新的多药耐药相关基因。方法　以HL- 6 0细胞为“驱动方”,以多药耐药细胞系HL- 6 0 / VCR为“实验方”,建立人白血病多药耐药细胞系HL-6 0 / VCR抑制消减杂交文库,利用基因芯片技术从中筛选出一条在野生型HL - 6 0细胞中基本不表达,而在HL - 6 0 / VCR耐药细胞中呈低丰度差异表达的新表达序列标记序列。用表达序列标记拼接的同源基因克隆法得到人类新基因HV12 6序列,再利用生物信息学数据库和软件对其进行功能的预测和分析。最后针对推导序列开放阅读框设计引物,逆转录-聚合酶链反应检测推导HV12 6基因序列在临床白血病患者化疗前后白血病细胞中的表达。结果　HV12 6的c DNA序列长1991bp,编码36 5个氨基酸,其编码蛋白序列局部与新近发现的在细胞凋亡与炎症反应中起重要作用的蛋白基序“PYRIN”存在约4 3%的相似性。逆转录-聚合酶链反应结果提示该基因与白血病细胞受化疗药物的作用和耐药存在联系。结论　HV12 6可能是与白血病细胞耐药相关的一条新基因,有必要对该基因进行进一步的实验室克隆与功能研究。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默热休克蛋白90β(heat shock protein90beta,Hsp90β)基因表达对Jurkat细胞生长的抑制作用。方法根据Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建针对Hsp90β基因的siRNA真核表达载体,应用LipofectamineTMLTX转染入Jurkat细胞后,Real-time PCR检测Hsp90βmRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90βsiRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测干扰前后对Jurkat细胞生长抑制作用。结果成功构建Hsp90β基因特异性的真核表达载体pSOS-Hsp90βi,转染Jurkat细胞后发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,Jurkat细胞Hsp90βmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。Hsp90β基因表达沉默后,Jurkat细胞增殖明显受抑(P<0.01),实验组与对照组的细胞凋亡率分别为:(2.69±0.34)%、(3.63±0.38)%、(19.56±0.62)%,细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βi control组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05)。结论靶向Hsp90β的siRNA下调Hsp90β表达对人白血病Jurkat细胞有明显的生长抑制作用。