摘要：车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)病是侵染百合等作物的危险性病害,亟待建立其监测防控体系,以防止其扩散传播。根据PlAMV的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的保守序列设计特异性检测引物,通过对引物浓度和反应退火温度进行优化,建立了以CP-2 F/R为特异引物,引物浓度为10μmol·L^(-1),退火温度为59.4℃的高效实时荧光定量PCR检测技术。该检测技术特异性强,灵敏度是RT-PCR的100倍,病毒最低检出浓度为13 copies·μL^(-1)。对75份田间百合样品进行检测,结果显示:RT-qPCR方法检测(29份,38.67%)高于RT-PCR检测出的阳性样品(21份,28.00%)。

摘要：【目的】百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)是危害重要食药用百合卷丹的主要病毒之一,每年给百合种植业造成数十亿的损失。通过原位杂交技术明确LMoV在卷丹顶端分生组织中的分布,为百合脱毒培养提供支撑。【方法】采用种植于贵州省清镇市的栽培卷丹作为试验材料,利用RT-PCR并于NCBI网站下载不同地方LMoV分离物构建进化树鉴定卷丹所携带的病毒种类,据检测结果选取LMoV为对象,基于LMoV基因组序列设计并制备RNA荧光探针,开展卷丹茎尖和根尖石蜡切片组织的RNA原位杂交,观察卷丹茎尖和根尖中LMoV的分布。【结果】RT-PCR检测表明卷丹材料侵染了LMoV,构建进化树发现本实验分离物与吉林和辽宁的LMoV分离物关系最近,原位杂交进而表明卷丹茎尖中LMoV杂交信号主要分布在顶端分生组织下方0.15-0.2 mm的组织中,靠近紧挨分生组织叶原基的初生叶基部有较弱的病毒杂交信号,靠近初生叶的成熟叶顶端中病毒荧光信号强烈,感染LMoV的卷丹分生组织中心纵切面无毒区大小为(0.4-0.6)mm×(0.15-0.2)mm;在根尖0.25 mm×0.2 mm分生组织中无杂交信号分布,在皮层细胞中信号最强烈,在根冠和根伸长区信号较弱。【结论】卷丹顶端分生组织及最接近顶端的一个叶原基[大小约(0.4-0.6)mm×0.2 mm]未发现病毒信号,可作为茎尖脱毒的起始材料。根顶端分生组织外侧根冠有较强病毒信号,不适合作为卷丹脱毒培养的外植体。

摘要：为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMo V cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMo V病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到c DNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的c DNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体p FGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMo V的RNAi植物表达载体p FGC5941-C2和p FGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。