摘要：该研究利用短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体沉默HT9急性早幼粒白血病耐药细胞MDR1基因表达,以提高细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。通过设计合成编码shRNA的DNA模板序列,定向克隆到pSilencer 2.1-U6 neo质粒,成功构建1个P-gp蛋白基因特异的shRNA表达载体,稳定电转染HT9细胞,实时荧光定量PCR分析MDR1 mRNA表达,Western blot检测细胞P-gp蛋白表达,流式细胞术检测P-gp蛋白外排泵功能,MTT法检测细胞对药物敏感性。结果显示,成功构建了shRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-MDR1,转染HT9细胞后,PCR检测重组质粒整合到HT9/sh-2.1-1细胞基因组DNA,获得稳定遗传;HT9/sh-2.1-1细胞MDR1 mRNA表达降低了78.84%(P<0.01),P-gp蛋白表达降低了48.27%(P<0.05),细胞内Rho123相对荧光强度由(10.8±0.58)%升高至(73.56±1.37)%;转染细胞对三尖杉酯碱、阿霉素敏感性明显增强,IC50分别由(2.06±0.15)μmol/L降至(0.57±0.01)μmol/L、(4.04±017)μmol/L降至(1.56±0.05)μmol/L。提示shRNA干扰表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-MDR1能够稳定、持久地抑制MDR1基因表达,并能有效增强HT9细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。

摘要：通过pSilencer 2.1质粒介导的RNAi技术沉默急性早幼粒白血病耐药HT9细胞的耐药基因mdr1表达,可提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。通过设计合成靶向mdr1基因的shRNA干扰片段,定向克隆到pSilencer 2.1-U6neo质粒中,成功构建沉默mdr1基因特异表达的shRNA表达载体,电转染HT9细胞后筛选阳性克隆扩大培养。采用实时荧光定量PCR、Western blot检测细胞mdr1基因表达情况,流式细胞术检测P-糖蛋白外排泵功能,MTT法和流式细胞技术检测细胞对药物敏感性和细胞周期分布。结果显示,构建的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1转染HT9细胞后,HT9/pU6/shRNA细胞mdr1 mRNA表达降低了78.84%(P<0.01),P-糖蛋白的表达量降低了48.27%(P<0.05),细胞内Rho123相对荧光强度由10.8%±0.58%升高至73.56%±1.37%;转染细胞对姜黄素敏感性明显增强,IC50由(24.10±0.83)μmol/L降至(5.10±0.14)μmol/L;耐药相对逆转率为84.74%±1.86%,与HT9细胞相比,经姜黄素处理的稳定转染细胞HT9/pU6/shRNA细胞周期阻滞在S、G2/M期。说明质粒介导的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达,能有效增强HT9细胞对姜黄素的敏感性。