摘要：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶,与许多癌细胞的生长有关。然而,目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统,首先设计CDK2基因的sgRNA片段,在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后,构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对转化子进行验证,最后转染HEK293T细胞,检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明,CDK2基因敲除载体构建正确;荧光显微镜检测显示,细胞转染效率在75%以上;细胞增殖检测表明,山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系,研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。

摘要：TLR4是天然免疫系统中的一种重要模式识别受体,可选择性地识别病原微生物而启动天然免疫,在宿主天然免疫和获得性免疫中具有重要作用。山羊TLR4基因与多种疾病相关,然而,目前在山羊上关于TLR4基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。采用CRISPR/cas9系统,首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,构建同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,最后对转化子进行验证,提取质粒并转染山羊成纤维细胞,通过测序进行敲除检测。结果表明:酶切和测序鉴定证明TLR4基因敲除载体构建正确。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续研究TLR4在支原体肺炎感染的免疫应答分子机制提供理论依据。

摘要：为验证GDF9基因是否与山羊产羔数存在关联性,采集具有1-5胎产羔记录的安徽白山羊经产母羊血样265份,提取血液总DNA;根据基因序列（Gen Bank：EF446168.2）和参考文献设计4对引物,利用PCR-SSCP方法检测GDF9基因2个外显子在安徽白山羊品种中是否存在遗传多态性,采用最小二乘均值法分析遗传突变位点不同基因型产羔数之间的差异。结果表明：在外显子1中存在1个SNP EF446168.2：c.1956A〉C（同义突变）,而在外显子2中存在2个SNPs（EF446168.2：c.3319G〉A,错义突变;EF446168.2：c.4085G〉A,同义突变）。群体遗传分析发现,3个SNP位点均存在3种基因型,优势基因型频率分别为AA（0.607 5）、GG（0.750 9）、GG（0.786 8）。关联性分析表明,在EF446168.2：c.1956A〉C位点,3种基因型安徽白山羊产羔数LSM（最小二乘均值）无显著差异;对EF446168.2：c.3319G〉A位点,AA型产羔数LSM分别比GG型个体和GA型个体LSM高0.77只和0.41只（P〈0.01）;对EF446168.2：c.4085G〉A,AA型个体产羔数LSM分别比GG型个体和GA型个体LSM高0.43只和0.28只（P〈0.01）。因此,GDF9基因与安徽白山羊产羔数密切相关,可能是影响产羔数的一个主效基因;EF446168.2：c.1956A〉C、EF446168.2：c.3319G〉A、EF446168.2：c.4085G〉A可能作为分子标记,应用于安徽白山羊多胎性育种。