摘要：目的分析人类转录因子X-盒结合蛋白1(X-box binding proteinⅠ,XBP1)基因启动子在不同细胞系中转录活性的差别,研究其转录调控机制。方法在对XBP1基因进行生物信息学分析的基础上,设计6种XBP1启动子缺失突变体,分别包括XBP1基因5′上游-1039~66bp、-859~66bp、-623~66bp、-351~66bp,-227~66bp、-227^-45bp,针对每一种缺失突变体构建相应的氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltansferase,CAT)报告基因载体,再分别瞬时转染K562、HepG2、NIH-3T3和L02细胞,应用报告基因CAT瞬时表达系统,检测XBP1每一种缺失突变体在K562、HepG2、NIH-3T3和L024种不同细胞中的活性差异,并进一步确定XBP1基因启动子的具体调节部位。结果成功获得XBP1基因启动子6种缺失突变体的正确克隆和6种相应的报告基因载体p1-XBP1p,p2-XBP1p,p3-XBP1p,p4-XBP1p,p5-XBP1p,p6-XBP1p,每一种报告基因转染K562、HepG2、NIH-3T3和L024种不同细胞系后,p4-XBP1p和p5-XBP1p在K562、HepG2细胞中的转录活性均高于其它报告载体,p5-XBP1p在HepG2细胞中转录活性最高;而6种报告基因载体在NIH-3T3小鼠成纤维细胞中不具有转录活性。结论XBP1基因的转录激活能力在不同细胞中有所差异,其表达活性具有一定的细胞类型特异性,与细胞类型和细胞状态密切相关;XBP1基因启动子的-227~66bp区域是该启动子的核心部位,而且核心启动子区包括ATG翻译起始密码子的下游部位,这一部位是转录活性的重要部位,一旦缺失,XBP1基因启动子会丧失活性。

摘要：目的利用酵母双杂交技术筛选线粒体促凋亡因子野生型Smac/DIABLO的相互作用蛋白。方法①设计促凋亡因子野生型Smac/DIABLO引物,利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增野生型Smac/DIABLO基因片段,构建酵母真核表达载体pDBLeu-Smac/DIABLO。②pDBLeu-Smac/DIABLO诱饵质粒转化酵母MaV203,Western blot检测融合蛋白在酵母中的正确表达,自激活作用的检测并确定抑制His基础表达的3AT浓度。③对成人肝cDNA文库的筛选。选择能同时激活His、Ura、LacZ3个报告基因的克隆为阳性,利用回转实验和GST-pull down对阳性克隆进行鉴定。结果成功构建pDBLeu-Smac/DIABLO载体,转化酵母细胞MaV203,无细胞毒性,无自激活作用,3AT浓度为25mmol/L。经回转实验和GST-pull down证实了线粒体促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1之间具有相互作用。结论Smac/DIABLO可能通过与核受体NR4A1的相互作用来影响核受体NR4A1对细胞生存或者凋亡的调控。

摘要：目的:采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌Ca Ski细胞株中HPV-16 E6基因的表达。为观察HPV-16 E6基因的小干扰片段能否在Ca Ski细胞特异性的抑制E6基因的表达,构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒,并观察其转染效率。方法:根据HPV-16 E6基因序列,设计特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至Ca Ski细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率。结果:通过酶切鉴定和序列测定,成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功的转染到Ca Ski细胞株中,转染效率达到50%以上。结论:siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础。