摘要：利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。

摘要：目的利用成簇的规律间隔短回文重复序列和相关蛋白9(clustered regular interval short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)的PIN1基因,以构建PIN1基因敲除长白猪胎儿成纤维细胞系。方法对人和猪的PIN1基因进行同源性分析。利用在线工具设计2个靶向猪PIN1基因第二个外显子区的sgRNAs,并克隆至pX330骨架质粒中。将构建成功的打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单细胞克隆,测序鉴定其基因型并从转录和翻译水平鉴定PIN1的表达。结果同源性分析显示人和猪PIN1蛋白的氨基酸序列一致性和相似性均为98%,二者三维结构的均方根偏差(RMSD)值为0.014。获得15个PIN1基因敲除的纯合单克隆细胞系,并且证实PIN1蛋白在翻译水平被完全敲除。结论利用双sgRNAs引导的CRSIPR/Cas9系统在PFFs中高效实现PIN1基因的双等位基因敲除,成功建立PIN1基因敲除的长白猪胎儿成纤维细胞系。

摘要：目的:利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法:首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具(http://***/E-CRISP/***)设计并合成单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果:生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论:人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体可以高效编辑PFF中的F9基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法:(1)利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。(2)设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到p X330载体上构建ACE2基因打靶载体。(3)将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果:根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。

摘要：目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPING1-/-猪模型的构建提供了必需的实验材料。

摘要：目的:基于CRISPR/Cas9技术构建猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)OSBPL2敲除细胞系,为构建小型猪致聋基因缺陷动物模型奠定重要的前期工作基础。方法:首先通过生物信息学方法对人与猪OSBPL2基因共线性和同源性进行分析,预测并模拟人与猪OSBPL2蛋白质二级、三级结构。其次,设计合成靶向猪OSBPL2第5、6外显子设计单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组载体,转染至猪PFFs中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,T7EN1酶切实验检测靶向效率,序列分析检测单克隆细胞基因型。结果:生物信息学分析结果表明人与猪的OSBPL2在染色体上具有较好的共线性关系,蛋白质氨基酸同源性高达88%,且具有相似的功能结构域。成功构建打靶OSBPL2基因的Cas9/sg RNA表达载体,转染PFFs细胞,药物筛选获得OSBPL2基因双敲的单细胞克隆并测序证实了基因突变型。结论:人和猪OSBPL2基因具有高度的同源性。构建成功的Cas9/sg RNA表达载体在PFFs中预期实现了OSBPL2基因编辑并获得基因双敲的单细胞克隆,为后续OSBPL2基因敲除猪模型构建提供了必需的实验材料。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除成体神经干细胞(neural stem cell,NSC)PIN1基因,建立PIN1基因敲除的成体神经干细胞系。方法:取8周龄C57BL/6小鼠脑室下区的脑组织进行体外培养;设计靶向小鼠PIN1基因的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以PX330质粒为骨架,构建PIN1的Cas9打靶载体,转染小鼠的成体神经干细胞,通过puro筛选和测序鉴定获得PIN敲除的单克隆细胞;利用免疫荧光染色和Western blot测定PIN1蛋白表达水平,免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特征性标志物巢蛋白(Nestin)的表达,Beta Ⅲ Tubulin免疫荧光染色鉴定神经干细胞分化为神经元的能力。结果:成功构建PIN1基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得PIN1敲除的神经干细胞克隆9个。免疫荧光染色及Western blot显示PIN1蛋白无表达,免疫荧光染色显示PIN1敲除的神经干细胞Nestin阳性,神经干细胞分化培养时可部分分化为BetaⅢTubulin阳性的神经元细胞。结论:CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现对小鼠成体神经干细胞PIN1基因的编辑。在PIN1基因敲除后PIN1蛋白无表达,初步表型分析显示,神经干细胞仍表达特征性标志物Nestin,并具有向神经元分化的能力。

摘要：为了模拟井下压裂作用下胶凝酸和清洁酸作用时的碳酸盐岩破裂机制,了解两种酸液体系作用后的强度劣化效应,进行了拟三轴岩石力学试验以及3-D扫描。试验结果表明:与胶凝酸反应后,碳酸盐岩弹性模量、泊松比和抗压强度均呈降低趋势,其中泊松比降低幅度明显,酸蚀90 min时,降幅达到18.15%;与清洁酸反应后,碳酸盐岩弹性模量、抗压强度在酸蚀初始阶段小幅提高,当酸蚀时间达到90 min后,两者降幅分别为21.04%及23.55%,泊松比降幅为4.36%,岩石力学性质劣化效应明显,脆性指数升高12.09%;与胶凝酸反应90 min后,碳酸盐岩的脆性指数提高58.56%,破裂压力呈下降趋势;与清洁酸反应后,裂缝壁面粗糙程度明显降低,裂缝导流能力呈降低趋势。酸压后的力学性质劣化特征可为酸化压裂设计及参数优化提供基础数据。

摘要：目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。