摘要：本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。

摘要：【目的】建立禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因的多重PCR方法,实现禽致病性大肠杆菌毒力基因的简便、快速检测。【方法】根据GenBank公布的基因序列,设计合成18对特异性引物,通过条件优化,建立四组多重PCR体系,并通过模板倍比稀释检测各组多重PCR的灵敏性。利用多重PCR检测100株APEC毒力基因的分布,验证多重PCR方法的可行性。【结果】根据PCR扩增片段大小判定,上述四组多重PCR体系均能同时扩增出该组中的各个毒力基因,且灵敏度分别为:103CFU、103CFU、105CFU、105CFU细菌和1ng、1ng、10ng、10ng DNA。100株APEC的毒力因子检测结果显示,多重PCR和单基因PCR结果一致。【结论】建立的四组多重PCR方法能够简便、快速地检测禽致病性大肠杆菌的毒力基因,可用于毒力基因的鉴定以及流行病学调查。

摘要：为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法,本研究通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针,并对体系进行优化,建立了一种可以同时检测p72、CD2v、MGF110-9L基因的多重q PCR方法。该方法与其他常见猪病毒性病原均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对p72、CD2v和MGF110-9L重组质粒标准品的最低检出限均为102copies/mL,敏感性好;组内变异系数为0.03%~0.5%,组间变异系数为0.04%~1.5%,表明该方法重复性好。利用本方法和普通qPCR方法分别对50份临床样品进行检测,结果显示,两种检测方法对ASFV核酸的检出率均为70%(35/50),符合率为100%。综上所述,本研究建立的多重qPCR方法为临床鉴别检测ASFV野毒株与基因缺失株提供了重要材料。

摘要：根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力相关基因E9的序列,设计并合成了1对特异性引物,以IMT5155菌株的基因组DNA为模板扩增了E9基因所在ORF的部分序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a(+)载体中,构建了原核表达质粒pET-28a-E9,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(32.2 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有免疫反应性。对重组蛋白进行纯化后免疫动物进行抗体效价测定,进一步分析重组蛋白的相关生物学功能,分别进行了细胞毒性试验、动物试验、细胞黏附与黏附影响试验。结果表明,该蛋白没有细胞毒性,对小鼠亦无毒性,有一定的黏附作用。

摘要：黏膜免疫在机体抵抗病原入侵时发挥着重要的作用,疫苗通过黏膜免疫可以引起局部和全身的免疫应答。但是疫苗经过消化道黏膜时常受到消化液的降解,而且常常会引起免疫耐受,为了克服这些困难,人们设计了大量的黏膜免疫佐剂以增强机体对抗原的黏膜免疫力和全身的免疫应答水平。作者就近年来黏膜免疫佐剂的研究进展作一综述。

摘要：[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O1、O2和O 783种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O1、O2和O 783种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O1、O2和O 78血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl 22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O1、O2、O78最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O1和O2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL^-1,O 78血清型的DNA最低检测限为0.02ng·μL^-1;以O 1、O2和O78混合DNA为模板时,最低检测限为0.05ng·μL^-1。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O1、O2和O783种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。

摘要：根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic ***,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。

摘要：为了建立非洲猪瘟病毒(ASFV)简捷、高效的基层临床检测方法,本研究选取非洲猪瘟病毒保守基因B646L(P72)序列,设计特异性引物和探针,建立非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。结果显示,所建立方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法灵敏度相当,低至10 copies,μL,检测时长仅需10 min,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均无交叉反应。对100份临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR结果一致,但相较于荧光定量PCR检测时间的2h,检测时间大大缩短。结果表明,本研究建立的方法灵敏度较高、特异性较好,为ASFV早期临床诊断提供了技术支持。

摘要：为研究禽致病性大肠杆菌F11毒力基因的功能,根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力基因F11的序列,设计合成特异性引物,通过PCR方法检测了毒力基因F11在禽致病性大肠杆菌中的分布,并以IMT5155基因组DNA为模板扩增F11基因片段,将其定向克隆到pET-28a(+)载体中构建原核表达质粒pET-28a-F11,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,纯化表达产物,制备免疫血清进行黏附抑制试验。结果显示,F11基因在禽致病性大肠杆菌中的分布率为22.2%(10/45),主要分布于大肠杆菌B2进化群中。利用F11免疫血清进行的Western-blot分析表明,F11可以在实验室培养条件下正常表达。黏附抑制试验显示,F11免疫血清可以抑制禽致病性大肠杆菌IMT5155对宿主细胞的黏附,表明F11可能在禽致病性大肠杆菌感染过程中发挥作用。

摘要：为了解我国新疆地区羊蓝舌病的流行情况,对某羊场疑似发生蓝舌病的羊病料进行了采集,并进行病毒分离和鉴定。应用间接ELISA试剂盒检测血清抗体,抗凝血样品接种敏感的BHK21细胞进行连续盲传,对细胞病变呈阳性的样品进行间接免疫荧光鉴定,同时针对VP7片段和VP2片段设计引物进行RT-PCR检测鉴定,并对其L2基因进行系统发育树分析。结果显示,血清中BTV抗体检测均为阳性,接种BHK21细胞后均产生了特异性细胞病变,并与FITC标记的抗BTV单抗特异性结合,针对VP7扩增出1156bp片段,针对VP2分别扩增出850bp和1581bp片段,经测序和序列分析确定为BTV-14型。结果表明,我国新疆地区存在蓝舌病毒14型,这也是我国境内首次分离到蓝舌病毒14型,为进一步防控我国蓝舌病疫情提供了科学依据。