摘要：目的构建稳定表达CD19的HeLa细胞株并鉴定其作为CD19嵌合抗原受体T(CD19-CAR-T)细胞的靶细胞功能。方法以NCBI中人CD19基因序列为模板,设计并合成引物,从Raji细胞中扩增CD19;酶切回收CD19片段和慢病毒载体pLVX-IRES-Puro,并行重组反应;重组载体pLVX-CD19-IRES-Puro基因测序;载体质粒与辅助质粒共转染HEK293T细胞,收集浓缩慢病毒,稀释计数法测定滴度;慢病毒感染HeLa细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达株,实时定量PCR和流式细胞术检测CD19表达;CD19-CAR-T细胞与CD19-HeLa细胞共培养,ELISA检测培养上清中白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。结果插入重组载体中的CD19序列无误;获得滴度为1×10^(8)转导单位(TU)/mL的CD19过表达慢病毒;在筛选所得的稳定表达株中,CD19的mRNA表达水平和膜蛋白表达水平显著高于对照组HeLa细胞;CD19-CAR-T细胞与CD19-HeLa细胞共培养后,IL-2、IFN-γ以及TNF-α分泌显著增加。结论稳定表达CD19的HeLa细胞株构建成功,且能作为CD19-CAR-T细胞的靶细胞。

摘要：目的:构建靶向GPC3阳性肝癌细胞的嵌合抗原受体修饰T细胞[chimeric antigen receptor-modified T cell,CAR-T cell],并评估其对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤效能。方法:选择偏爱密码子技术改造基因序列,以增强CAR分子表达效率,设计靶向GPC3抗原的CAR分子基因并构建携带GPC3-CAR基因的慢病毒表达载体p CDH-GPC3-CAR,感染T细胞;采用Western blotting、流式细胞术、实时细胞监测和ELISA技术分别检测GPC3-CAR分子在CAR-T细胞的表达、慢病毒感染T细胞效率、GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性肝癌细胞的杀伤活性和特异性。结果:双酶切p CDH-GPC3-CAR重组慢病毒质粒可见分子质量和GPC3-CAR分子一致的基因片段,成功构建p CDH-GPC3-CAR慢病毒质粒。约54.38%的GPC3-T细胞表达GPC3-CAR分子,称为GPC3-CAR-T细胞。GPC3-CAR-T细胞对GPC3阳性的肝癌细胞Huh-7比GPC3阴性的肝癌细胞SK-HEP-1具有更高效的杀伤能力[(78.96±4.76)%vs(6.87±3.15)%,P<0.01]。与GPC3阳性Huh-7肝癌细胞共培养的肝癌GPC3-CAR-T细胞分泌IFN-γ水平比Mock组高效[(21 371.4±1 808.3)vs(152.8±12.5)pg/ml,P<0.01],这可能是其高效杀伤肝癌细胞的机制之一。结论:靶向肝癌的GPC3-CAR-T细胞具有高效分泌IFN-γ细胞因子并特异高效杀伤GPC3阳性肝癌细胞的能力,为进一步推进GPC3-CAR-T临床前和临床研究奠定基础。

摘要：目的卵巢叶酸受体α(αFR)在上皮性卵巢癌中高表达。文章拟构建靶向αFR的嵌合抗原受体(CAR)修饰NK-92细胞(NK-92-αFR-CAR),并验证其对αFR阳性靶细胞的杀伤效能,为卵巢癌的临床治疗提供新策略。方法选择偏爱密码子技术设计人源化抗αFR抗原的CAR分子基因;构建慢病毒表达载体pLenti-αFR-CAR;包装慢病毒并感染NK-92细胞;Western blot、qPCR及流式细胞术检测αFR-CAR分子在NK-92细胞中的表达效率。LDH释放实验和ELISA检测NK-92-αFR-CAR细胞对αFR阳性卵巢癌细胞的杀伤活性。结果双酶切pLenti-αFR-CAR重组质粒可见分子质量和αFR-CAR分子一致的基因片段。Western blot和qPCR证明αFR-CAR分子在NK-92细胞中确有表达,并且经嘌呤霉素筛选后,αFR-CAR的表达效率超过90%。NK-92-αFR-CAR细胞对卵巢癌细胞的杀伤效应及细胞因子分泌水平呈抗原依赖性,即肿瘤细胞表面αFR表达水平越高,NK-92-αFR-CAR细胞对其杀伤效应越强。NK-92-αFR-CAR细胞与SK-OV-3细胞或A2780细胞共培养后,其IFN-γ分泌水平(5007.81±180.37、2668.30±180.37)较NK-92细胞(360.80±8.44、285.86±12.39)和NK-92-EV细胞(378.75±21.76、292.10±21.76)表达更高(P<0.01);TNF-α分泌水平(964.27±74.95、585.73±83.53)较NK-92细胞(247.92±5.96、231.03±10.47)和NK-92-EV细胞(230.04±13.66、215.13±7.89)表达更高(P<0.01)。但与A-431细胞共培养,3种细胞中IFN-γ和TNF-α表达差异无统计学意义(P<0.05)。结论NK-92-αFR-CAR细胞具有分泌大量IFN-γ和TNF-α细胞因子并特异杀伤αFR阳性卵巢癌细胞的能力,这为NK-92-αFR-CAR细胞进入后续的临床前和临床研究奠定了基础。