摘要：为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型与基因Ⅲ型的方法,根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1、P3和P2、P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型与Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并用建立的方法对27份临床样品进行了检测。结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,得到与基因Ⅰ型JEV预期相符的381bp的特异性条带,得到与基因Ⅲ型JEV预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病病毒核酸的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为1.0pg/μL和10pg/μL。利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品进行检测,结果5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型与基因Ⅲ型JEV。

摘要：为对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M蛋白进行截短原核表达并建立ELISA检测方法,设计引物扩增了含M基因抗原位点的基因片段,并构建了原核表达载体pET-32a-dM;将pET-32a-dM转化大肠杆菌Rosetta(DE3),获得了高效表达,表达产物大小为27ku。蛋白免疫印迹结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA检测方法,方阵滴定试验确定重组蛋白抗原的最佳包被质量浓度为13.07μg/mL,血清稀释度为1∶80,酶标抗体1∶4 000稀释。阳性判定标准确立为D450nm≥0.3,反之则判为阴性。建立的ELISA与猪乙型脑炎病毒、胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的阳性血清均无交叉反应,说明它特异性好。批内与批间重复性试验的平均变异系数分别为3.53%及6.82%,说明重复性较好。用该方法检测52份血清,特异性为87.5%,敏感性为90.0%,与商品化ELISA试剂盒的符合率为88.5%。本研究结果表明,截短表达的M蛋白可以作为诊断抗原,建立的ELISA方法完善后可用于PRRSV抗体的检测。

摘要：目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒(FMDV)的一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针;通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;分别以质粒和病毒RNA为模板,构建标准曲线;并进行特异性、敏感性、重复性试验。结果该方法能特异性检测A型、O型、Asia 1型FMDV,而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性;构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR敏感性高10倍;对4份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。结论建立的口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。

摘要：目的对2009年分离自四川省崇州与内江地区的2株乙型脑炎病毒的E基因进行序列测定与分析,了解其序列特征与遗传变异情况。方法采集猪场流产死胎脑组织与蚊虫样品12份,用BHK-21细胞分离培养出2株乙型脑炎病毒,命名为JEV-CZ1株和JEV-NJ1株。针对乙脑疫苗株SA14-14-2基因组252-2509区段设计1对引物,扩增出分离株主要抗原基因E基因并测序,与不同国家及地区的乙脑毒株进行E基因核酸序列及推导氨基酸序列的同源性比较与进化树分析。结果测序分析的E蛋白基因片段长1 500bp,编码500个氨基端残基。JEV-CZ1株与广泛使用的减毒疫苗株SA14-14-2的E基因核酸序列与推导氨基酸序列的同源性分别为87.6%和97.2%,JEV-NJ1株与SA14-14-2株的E基因核酸与氨基酸序列的同源性分别为99.5%与99.2%。JEV-CZ1株与疫苗株SA14-14-2株在E蛋白3个结构域中有15个氨基酸的差异,JEV-NJ1株有3处差异。其中JEV-CZ1株在E138位的氨基酸为Glu,符合强毒特征。通过基因遗传进化分型显示,JEV-CZ1株为基因Ⅰ型,JEV-NJ1株为基因Ⅲ型,且2株病毒与以往四川分离的毒株遗传关系较近。结论此次研究的分离株具有较强的地域性,遗传变异不大,且与疫苗株有较高的同源性。

摘要：进行了几种主要禽疫病诊断基因芯片制备及其初步应用研究。试验分别设计和克隆鉴定了NDV、IBV、AIV和IBDV的靶基因重组质粒。以克隆的靶基因重组质粒为模板,分别进行PCR扩增制备靶基因并纯化,以基因芯片点样仪将制备的靶基因点制在氨基化的基片上,经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后,成功制备了NDV-IBV-AIV-IBDV诊断基因芯片。试验应用CY3荧光标记制备的探针进行芯片的检验,结果表明制备的NDV-IBV-AIV-IBDV诊断基因芯片质量好,可对NDVI、BV、AIV和IBDV进行诊断检测,具有检测灵敏性好,特异性高和芯片可重复检测的优点。试验对30个临床样品进行初步应用检测,结果表明该诊断基因芯片技术与RT-PCR检测技术检出率基本一致,并具有同步诊断检测多种疫病的优点。

摘要：在日益激烈的市场竞争中，如何让企业品牌脱颖而出？除了产品创新，相信更为有效的方式便是广告营销。而要让企业的品牌真正深入人心，除了营销的持续性、传播平台的权威性，更要注重营销方式创新。如此之下。企业品牌才能在日益趋同化的产品竞争中赢得关注。

摘要：为了适应大气,海洋的环境数值模拟需要,在前人工作基础上提出了三维随流格式和指数型迎风格式。随流格式能使方程对流项中的对流速度误差明显减小。三维指数型迎风格式能有效抑制对流占优问题的数值振荡,并用简单的七点差分格式获得O（h2）精度的三维模式数值结果。因此,所建的模式具有格式简单,计算稳定性良好和计算精度较高的优点。初步计算表明,这个模式能有效应用于强迫-耗散型大气、海洋运动和环境问题的数值模拟。

摘要：5月16日,由市文创办、市文广新局、杭报集团主办的第九届杭州艺术博览会在浙江世贸国际展览中心圆满落幕。为期四天的艺博会共有三万余人到现场参与,成交额突破千万元,让全国乃至全球的画廊机构、艺术家、藏家看到了杭州艺术市场的新机遇。

摘要：本研究同时采用常规PCR和不对称PCR分别进行靶基因片段生物素标记,应用于金标银染可视化基因芯片,分析其对猪腹泻病毒可视化共检基因芯片杂交效率的影响。分别选取猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）的N和S基因,A型猪轮状病毒（group A porcine rotavirus,GAR）的VP7和NSP4基因设计引物。根据目的基因片段设计60-mer寡核苷酸探针,在其5′端修饰15个T碱基后,利用芯片点样仪喷样于醛基玻片上制成基因芯片。应用常规PCR和不对称PCR两种生物素标记方法,对本实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,在相同条件下与基因芯片进行杂交。利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,将链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过银离子染色后直接眼观试验结果。结果表明,应用此可视化共检芯片特异性好,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV杂交结果均呈阴性。不对称PCR标记法可有效提高杂交效率,不对称PCR标记技术和常规PCR标记技术的最低检测浓度分别为10^5copies/L和10^7copies/L,前者的灵敏性是后者的10～100倍。应用不对称PCR标记技术对样品进行生物素标记后,可明显提高腹泻病毒可视化共检芯片的杂交效率,有利于检测型可视化基因芯片的应用。

摘要：首次为整个东中国海设计出一种自适应网格 ,利用自适应网格能同时兼顾网格的光滑性、正交性及疏密程度的特点 ,得到了物理平面上的网格分布。该网格既与边界适应 ,又在水深变化急剧的东海陆坡处得以加密 ,从而使坐标变换下的三维模式成功实现了跨越陆坡的计算。用该模式模拟了海域的潮汐变化。依据所得结果绘制出 M2 分潮的同潮图和潮流椭圆。模拟结果与现有的数值研究结果基本一致 。