摘要：本研究旨在研制猪圆环病毒2型(PCV2)-副猪革拉瑟菌(GPS)二联菌影疫苗,并评价其在小鼠上的免疫保护效果。选择GPS 5型菌株SH0165作为疫苗株,利用氢氧化钠最低抑菌浓度法将其制备成菌影,再将PCV2的ORF2基因克隆至pEGFP-N1真核表达质粒,将GPS菌影作为PCV2 DNA疫苗的载体,构建PCV2-GPS二联菌影疫苗,设计了商品化疫苗组、PCV2-GPS二联菌影疫苗组、菌影组、质粒组、PBS组、空白组,对4周龄BALB/c小鼠进行免疫,测定免疫后PCV2和GPS的IgG抗体效价、PCV2中和抗体、脏器中PCV2病毒载量、血清杀菌率、GPS攻毒保护率以及血清中细胞因子(IFN-γ、IL-12)水平。结果显示:二联菌影疫苗组小鼠血清中PCV2和GPS的IgG抗体水平显著增高,PCV2中和抗体滴度提高,PCV2攻毒后的小鼠淋巴结和肺脏中病毒载量下降,血清杀菌率显著提高,GPS攻毒后免疫保护率达70%(7/10),小鼠血清中IFN-γ含量显著上调。综上表明,PCV2-GPS二联菌影疫苗显著激活了小鼠对PCV2和GPS的体液免疫反应和细胞免疫反应,且能够抑制PCV2在小鼠体内的增殖,对感染GPS的小鼠达到较好的保护效果,为新型安全高效的PCV2、GPS联合疫苗的研制提供了生物材料和实验数据。

摘要：猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种能引起仔猪呕吐、腹泻和脱水的新的猪肠道冠状病毒,表达了PDCoV的S基因抗原表位区(S1-CTD)并建立了检测抗体的间接ELISA方法。根据S基因序列设计引物,扩增含中和抗原表位的S1-CTD区(位于S基因的832-1 848 bp),构建原核表达载体pET28a-S1-CTD,表达的重组S1-CTD蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约41 kD,Western Blot证明其有良好的反应原性。以重组S1-CTD 蛋白为抗原建立间接ELISA,抗原最佳包被浓度为1μg/孔,待检血清的最佳稀释度为1∶50,阴阳性临界值为OD_(450nm)≥0.377。该ELISA检测其他8种常见猪病阳性血清无交叉反应,特异性好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性好。ELISA与病毒中和试验的总符合率达83.3%。用建立的ELISA检测了2012-2017年四川部分猪场490份临床血清,结果显示血清中PDCoV抗体阳性率为49.18%。

摘要：为对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M蛋白进行截短原核表达并建立ELISA检测方法,设计引物扩增了含M基因抗原位点的基因片段,并构建了原核表达载体pET-32a-dM;将pET-32a-dM转化大肠杆菌Rosetta(DE3),获得了高效表达,表达产物大小为27ku。蛋白免疫印迹结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA检测方法,方阵滴定试验确定重组蛋白抗原的最佳包被质量浓度为13.07μg/mL,血清稀释度为1∶80,酶标抗体1∶4 000稀释。阳性判定标准确立为D450nm≥0.3,反之则判为阴性。建立的ELISA与猪乙型脑炎病毒、胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的阳性血清均无交叉反应,说明它特异性好。批内与批间重复性试验的平均变异系数分别为3.53%及6.82%,说明重复性较好。用该方法检测52份血清,特异性为87.5%,敏感性为90.0%,与商品化ELISA试剂盒的符合率为88.5%。本研究结果表明,截短表达的M蛋白可以作为诊断抗原,建立的ELISA方法完善后可用于PRRSV抗体的检测。

摘要：为建立一种简单快捷的鉴别日本脑炎病毒(JEV)基因Ⅰ型与基因Ⅲ型的方法,根据基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的保守序列,分别设计合成了针对基因Ⅰ型和Ⅲ型JEV的RT-PCR引物P1、P3和P2、P3,以JEV SA14-14-2和CZ1株的核酸提取液为模板,通过对反应体系及条件的优化,建立了一种可快速鉴别JEV基因Ⅰ型与Ⅲ型的复合RT-PCR方法,并用建立的方法对27份临床样品进行了检测。结果显示,以设计合成的引物进行复合RT-PCR扩增,得到与基因Ⅰ型JEV预期相符的381bp的特异性条带,得到与基因Ⅲ型JEV预期相符的550bp的特异性条带,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病病毒核酸的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该方法对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV的最小检出量分别为1.0pg/μL和10pg/μL。利用建立的复合RT-PCR方法对27份临床样品进行检测,结果5份为基因Ⅰ型,2份为Ⅲ型,与核苷酸序列分析结果一致。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于检测及鉴别基因Ⅰ型与基因Ⅲ型JEV。

摘要：本研究旨在利用金标银染显色技术,构建同时检测禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克病病毒(MDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的可视化基因芯片。利用T-A法分别克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp_2基因,并利用本实验室已保存的AIV-np、NDV-f、ILTV-tk基因序列,设计寡核苷酸探针,制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV基因芯片阵列。引入生物素标记的引物进行PCR扩增,并与芯片进行杂交银染显色,肉眼观察检测结果,并对芯片的特异性、敏感性、稳定性进行评价,以及临床初步验证。成功克隆ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp_2共3个靶基因,测序鉴定其正确性。发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol·L^(-1),40℃条件下杂交2 h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的质量浓度为4μg·mL^(-1),银染5 min,可见明显的检测信号。特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,且以鸡传染性支气管炎病毒为模板制备的PCR扩增标记不与ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV芯片杂交。芯片检测的灵敏度为1 pg·μL^(-1)。芯片在常温条件下保存60 d,在4℃条件下保存75 d仍可进行有效检测。临床病料检测结果与PCR检测结果一致。本研究成功构建同时检测ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金标银染可视化基因芯片,并确定其最佳反应条件,为临床标准化应用奠定了基础。

摘要：本研究同时采用常规PCR和不对称PCR分别进行靶基因片段生物素标记,应用于金标银染可视化基因芯片,分析其对猪腹泻病毒可视化共检基因芯片杂交效率的影响。分别选取猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）的N和S基因,A型猪轮状病毒（group A porcine rotavirus,GAR）的VP7和NSP4基因设计引物。根据目的基因片段设计60-mer寡核苷酸探针,在其5′端修饰15个T碱基后,利用芯片点样仪喷样于醛基玻片上制成基因芯片。应用常规PCR和不对称PCR两种生物素标记方法,对本实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,在相同条件下与基因芯片进行杂交。利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,将链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过银离子染色后直接眼观试验结果。结果表明,应用此可视化共检芯片特异性好,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV杂交结果均呈阴性。不对称PCR标记法可有效提高杂交效率,不对称PCR标记技术和常规PCR标记技术的最低检测浓度分别为10^5copies/L和10^7copies/L,前者的灵敏性是后者的10～100倍。应用不对称PCR标记技术对样品进行生物素标记后,可明显提高腹泻病毒可视化共检芯片的杂交效率,有利于检测型可视化基因芯片的应用。

摘要：本试验旨在建立同步共检猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的多重RT-PCR检测方法。参照PEDV的M基因(JQ023161)、TGEV的N基因(JX013850),RV的VP7基因(AY707788),利用Primer Premier 5.0软件设计筛选能特异性扩增PEDV、TGEV、RV相应基因的引物。并对引物浓度、退火温度等扩增条件进行优化,建立了一种能同时共检PEDV、TGEV和RV的多重RT-PCR方法。该方法对PEDV、TGEV和RV均能分别扩增出大小为347、779和510bp的预期片段;该方法灵敏度高,最低可以检测约1.5×105拷贝的阳性RNA模板;该检测方法特异性强,TGEV、PEDV、RV三种病毒核酸检测体系内无交叉反应,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本脑炎病毒和伪狂犬病病毒的RNA或DNA检测均为阴性。应用该方法检测135份临床样品,TGEV、PEDV和RV的阳性检出率分别为2.96%、82.2%和2.22%,与常规单一RT-PCR的检测结果进行比较分析,符合率均为100%。上述研究结果表明该方法是一种简便、快速、同步共检PEDV、TGEV和RV的有效方法。

摘要：为建立一种快速、灵敏、特异的鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的反转录-环介导等温扩增方法,根据Gen Bank中登录的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV毒株基因序列,分别设计了1套基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP引物,并以此引物分别建立了基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法。结果显示,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型特异性RT-LAMP方法均能在1 h内完成对相应基因型JEV RNA的扩增,并与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒和伪狂犬病病毒无交叉反应。灵敏性试验结果显示,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特异性RT-LAMP方法均能扩增出24 copies的JEV RNA。本研究建立的基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV特异性RT-LAMP检测方法具有灵敏性高、特异性好、简便、快速的特点,能够快速对JEV进行检测及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别,具有广泛的应用价值。

摘要：为研究副猪嗜血杆菌(HPS)链霉素(SM)抗性的分子基础,本实验采用甲基磺酸乙酯(EMS)间断传代诱导HPS SC1401菌株,构建SM抗性突变株,测定其对SM的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并对其耐药基因rpsL和rrs进行测序;通过对比分析筛选出rpsL基因中两个引起SM完全耐药的突变位点;为了进一步验证突变位点与抗性的关联性,设计位点突变引物以构建突变型质粒,并分别转化到亲本株中,获得单一位点突变菌株,测定其对SM的MIC和MBC。结果显示:EMS诱导的SM抗性突变菌株rpsL基因第43号(AAA→AGA)或第88号密码子(AAA→AGA)发生了突变,rrs基因未检测到突变;该抗性突变菌株与单一位点突变菌株1401D43和1401D88对SM的MIC和MBC均大于8 192μg/mL,远高于亲本株SC1401的SM抗性水平。实验结果表明,HPS的SM抗性主要由rpsL基因特定位点突变引起,其中,rpsL基因第43号和第88号密码子为主要突变位点。本实验为完善HPS耐药分子机制研究,特别是对氨基糖苷类药物产生耐药的分子基础提供一定的参考。

摘要：为有效表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的ORF3蛋白并检测表达产物的生物活性,开展了ORF3蛋白相关的生物信息分析(包括遗传进化分析、跨膜区、亲水性、抗原表位、二级结构等),以预测结果为依据,选取抗原区域进行了截短原核表达。根据CV777株的ORF3基因序列,设计了1对特异性引物,以RTPCR扩增了大小为342 bp的ORF3截短基因片段,将扩增的ORF3基因插入p ET-22b(+)载体中构建了原核表达质粒p ET-22 b(+)-ORF3。确定了最佳表达条件为诱导温度25℃、诱导时间4 h、IPTG浓度1.2mmol/L,表达的蛋白主要以包涵体形式存在,大小约18 ku。Western-blot和ELISA试验证明,该蛋白与PEDV阳性血清有良好的反应性。