摘要：目的开发新型二聚体突变荧光引物技术，建立一种能广泛应用于临床检测HCV的实时PCR方法。方法构建重组质粒pMD18-T—HCV5’NCR作为标准品，设计二聚体突变荧光引物，优化定量PCR体系，并进行方法学评价。将本法应用于临床确诊的30份HCV阳性患者、30份其他病毒性肝炎患者和30份健康志愿者血清标本的检测，定量结果与商品化TaqManHCV定量试剂盒的定量结果进行比较。结果建立了利用二聚体突变荧光引物的实时PCR方法，检测的线性范围为20-10^9IU／ml；批内CV在1．37％-4．59％之间，批间CV在1．58％-4．81％之间；对所有其他病毒性肝炎患者和健康志愿者血清HCV的检测结果均阴性，检测特异性为100％（60／60）；对临床确诊的HCV感染患者血清标本全部检出HCV阳性，定量结果与商品化TaqManHCV定量试剂盒的定量结果具有很好的相关性，相关系数R2=0．9501。结论建立的以二聚体突变荧光引物为平台的HCV实时PCR检测方法，具有快速、价廉、准确、结果可靠等特点，可为HCV感染的诊断、治疗监测和流行病学调查提供较好的技术支持。

摘要：肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展过程受诸多因素的影响。近年研究发现，信号转导和转录激活因子（STAT）具有强烈的抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变，其中以STAT3尤为活跃。本研究利用RNA干扰（RNAi）技术，用短发夹样RNA（shRNA）设计并构建RNAi-DNA质粒，筛选稳定表达小干扰RNA（siRNA）的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株，体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力，从而探索肝癌治疗的新方法。

摘要：目的 构建肝细胞生长因子（HGF）mRNA定量标准，建立实时荧光定量（FQ）-PCR检测体系，探讨其检测淋巴瘤的应用价值。方法 提取总RNA，行逆转录（RT）-PCR，获HGF cDNA目标片段并构建重组质粒，作为定量标准。设计第二引物对和探针，确定扩增条件，优化组分浓度，建立HGF mRNA实时FQ-PCR检测体系，并定量检测47例淋巴瘤患者[霍奇金病（HD）11例，非霍奇金淋巴瘤（NHL）36例；治疗后，获缓解34例，未缓解13例]和19例非肿瘤患者的淋巴组织标本中HGF mRNA表达。同时，用受试者工作特征（ROC）曲线法，评价其在淋巴瘤诊断中的敏感度和特异度。结果 本研究构建的HGF mRNA定量标准和实时FQ-PCR检测体系的标准曲线斜率为-3．513，相关系数为0．999，扩增效率达92．6％；批内、日内和日间变异系数分别为2．1％、4．0％和6．8％；灵敏性达2拷贝／μl。HGF mRNA在淋巴瘤组的表达（6．425±2．172）显著高于非肿瘤对照组（0．317±0．192，t=15．883，P〈0．001），缓解组的表达（6．157±1．712）显著低于未缓解组（7．591±1．184，t=2．768，P〈0．05），但在HD组和NHL组的表达差异无统计学意义（P〉0．05）。ROC曲线提示，当临床诊断临界值为3．316时，HGF mRNA对淋巴瘤诊断的敏感度和特异度分别为93．6％和100％。结论 本研究成功构建了HGF mRNA的定量标准和实时FQ-PCR检测体系，并可用于淋巴瘤的HGF mRNA定量检测。

摘要：天蚕素A(Cecropin A,CA)是来源于惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)的含有37个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广等特点。为降低天蚕素A对宿主的毒性及提高其表达丰度和稳定性,在序列分析的基础上设计了3条天蚕素A氨基酸序列,分别为CA19、CA36和CA210。根据大肠杆菌密码子的偏爱性分别合成相应的3对寡核苷酸链,并通过重叠PCR方法合成成熟肽CA。将含有CA19、CA36、CA210和CA1～5个拷贝基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和BLR(DE3)PlysS,成功构建了串连融合表达载体,为下一步的抗菌活性及免疫表位的分析打下基础。

摘要：目的探讨应用RNA干扰技术沉默信号转导和转录激活因子3(STAT3)基因对膀胱癌T24及5637细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人膀胱癌T24及5637细胞。通过半定量RT-PCR、Western印迹检测STAT3基因不同水平的表达情况,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、流式细胞仪检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果成功构建pGenesil-1-shR-NA-STAT3重组质粒,并成功转染T24及5637膀胱癌细胞;半定量RT-PCR、Western印迹检测结果显示,重组质粒实验组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组(P<0.05);MTT实验、流式细胞仪检测结果显示,重组质粒实验组细胞的增殖明显受到抑制并出现凋亡现象。结论pGenesil-1-shRNA-STAT3转染T24及5637膀胱癌细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制膀胱癌细胞的生长及增殖。

摘要：目的 探讨应用RNA干扰(RNAi)技术沉默信号转导子与转录活化子(STAT3)基因对膀胱癌细胞株T24及5637细胞的影响.方法 针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,转染人类膀胱癌细胞株T24及5637细胞.通过半定量RT-PCR、Western blotting法检测STAT3基因不同水平的表达情况,采用流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化.结果 成功构建pGenesil-1-shRNA-STAT3重组质粒,并成功转染T24及5637膀胱癌细胞;半定量RT-PCR、Western blotting结果显示,重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组(P<0.05);流式细胞仪的结果显示,重组质粒转染组细胞明显受到抑制并出现凋亡现象.结论 pGeneSil-1-shRNK-STAT3转染膀胱癌细胞株T24及5637细胞后,可有效抑制STAT3的表达,并抑制膀胱癌细胞的生长.

摘要：目的构建肝细胞生长因子(HGF)mRNA定量标准,建立实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测体系,探讨在淋巴瘤的应用价值。方法提取总RNA,行RT-PCR,获HGF cDNA目标片段并构建重组质粒,作为定量标准。设计第二引物对和探针,确定扩增条件,优化组分浓度,建立HGF实时FQ-PCR检测体系,并进行方法学评价。应用该检测体系定量检测47例淋巴瘤的HGF mRNA表达,并采用受试者工作特征(ROC)曲线法,评价其在淋巴瘤诊断中的敏感度和特异度。结果成功构建了HGF定量标准,结合热启动PCR和降落PCR技术创建了HGF mRNA实时FQ-PCR检测体系。方法学评价实验表明:标准曲线的斜率为-3.513,相关系数为0.999,扩增效率达92.6%;批内、批间和日间变异系数分别为2.1%、4.0%和6.8%;灵敏度达2拷贝/μl。HGF mRNA在对照组和淋巴瘤组的表达分别为0.317±0.192和6.425±2.172,组间差异具统计学意义(P&lt;0.001),但HD组和NHL组的表达无显著差异(P&gt;0.05),而缓解组显著低于复发组(P&lt;0.05)。ROC曲线法提示,当临床诊断界值为3.316时,HGF mRNA对淋巴瘤诊断敏感度和特异度分别为93.6%和100%。结论成功构建了HGF mRNA定量标准。建立的HGF mRNA FQ-PCR检测体系是理想的、可行的,可定量检测淋巴瘤HGF mRNA并具诊断价值。