摘要：目的制备甲型H1N1流感病毒核酸检测标准阳性模板,将其应用于日常甲型流感病毒荧光定量PCR(RTPCR)检测中。方法根据甲型H1N1流感病毒基因序列设计出M、HA、NA片段的全基因扩增引物,采用RT-PCR方法扩增以上3个基因片段,将3个目标片段分别连接到PGM-T载体上构建重组质粒,筛选出分别含M、HA、NA基因阳性质粒,将以上阳性质粒两两连接,最后制备成含M、HA、NA基因的标准阳性模板。结果此模板在-20℃保存3个月对荧光定量PCR结果无显著影响,具有较好的稳定性,Ct值最大变异系数为1.30%。使用该模板建立的定量范围为1×1010copy/ml^1×1019copy/ml,标准曲线方程为:y=-2.7232x+40.99。检测方法表明该标准阳性模板具有良好的特异性。结论本次制备成的标准阳性模板适用于各甲型H1N1流感病毒检测实验室的质量控制,可用于临床诊断。

摘要：目的建立可同时检测苏丹、扎伊尔、本迪布焦和科特迪瓦4种致病性亚型埃博拉病毒的双重荧光RT-PCR检测方法。方法根据4种致病性亚型埃博拉病毒的核蛋白NP基因保守序列,针对苏丹型/扎伊尔型病毒以及针对本迪布焦型/科特迪瓦型病毒,相应设计2套引物和探针。以体外转录的4种亚型埃博拉病毒RNA为模板,进行条件的优化以及方法特异性、灵敏度、重复性试验,建立双重荧光RT-PCR检测方法。结果新建立的双重荧光RT-PCR方法检测只对4种埃博拉病毒阳性对照RNA模板有特异性扩增,与肾综合征出血热病毒、登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、基孔肯雅病毒均无交叉反应,2套引物和探针的检测灵敏度均可达到最低50拷贝/μL。苏丹型和本迪布焦型埃博拉病毒阳性对照RNA模板的4种稀释度(2×108、2×106、2×104、2×102拷贝/μL)重复检测3次均有较好的重复性。结论建立的方法能同时检测上述4种亚型埃博拉病毒,灵敏度高,特异性强,可用于埃博拉病毒疑似病例的检测。