摘要：目的构建法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl diphosphate farnesyl transferase 1,FDFT1)基因重组质粒并在人胚肾上皮细胞(293T)验证质粒表达。方法设计FDFT1基因引物并经两次PCR扩增获取FDFT1目的基因;用相应的限制性内切酶将pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(pCDH-GFP)质粒线性化;FDFT1基因及线性化载体经纯化后以同源重组反应连接构建重组质粒;重组质粒通过菌落PCR、双酶切验证并测序做进一步验证;在293T细胞中利用三质粒共转染法包装FDFT1目的质粒并收集含病毒的上清液;以病毒液感染293T细胞验证FDFT1基因表达。结果菌落PCR及双酶切说明目的基因成功插入载体质粒,测序结果说明重组质粒中FDFT1基因与NCBI中登记的相应基因同源。构建成功的pCDH-GFP-FDFT1质粒包装为慢病毒后感染293T细胞,可检测到细胞中FDFT1基因表达与对照病毒感染相比升高15.13倍。结论本研究成功构建高表达FDFT1基因的重组慢病毒表达载体,为进一步研究FDFT1基因在肿瘤中的作用机制提供了实验基础。

摘要：目的构建NOC2L基因重组慢病毒并使其在293T细胞中表达。方法通过设计引物及PCR扩增获得NOC2L全基因片段,将pCDH-GFP载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切制备线性化载体;NOC2L全基因片段和线性化载体经切胶回收后,通过同源重组反应将NOC2L全基因片段连接到线性化的pCDH-GFP载体上,构建pCDH-NOC2L-GFP慢病毒表达载体;通过菌落PCR、质粒双酶切、测序等方法对构建的NOC2L基因重组慢病毒表达载体进行鉴定,利用构建的pCDH-NOC2L-GFP包装NOC2L慢病毒并使用该慢病毒感染293T细胞。结果菌落PCR、质粒双酶切和测序结果显示成功将NOC2L基因连接到pCDH-GFP载体上,使用构建成功的pCDH-NOC2L-GFP转染293T细胞,能够成功转染及包装NOC2L基因重组慢病毒,同时包装好的NOC2L基因重组慢病毒能够成功感染293T细胞并过表达293T细胞中的NOC2L基因。结论采用本研究方法能成功构建NOC2L基因重组慢病毒表达载体。