摘要：目的:建立RNA多聚酶Ⅱ-染色质免疫沉淀-引物延伸-飞行时间质谱技术(PolⅡ-ChIP-PE-MS),并利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量,为活体状态下研究疾病关联基因SNP的功能研究提供一种高通量的研究手段.方法:采用PCR-RFLP方法对HepG2细胞印迹基因SNRPN(仅父源等位基因表达)基因组DNA和cDNA进行基因分型,利用PolⅡCTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀,针对SNP位点两侧序列设计PCR引物和延伸引物,以外侧引物进行PCR扩增,采用延伸引物进行VLET引物延伸,产物纯化后经MALDI-TOF质谱鉴定.结果:对SNRPN杂合子细胞的SNRPNC1654312TSNP进行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析发现,基因组DNA样本和染色质免疫沉淀前样本在C、T等位点都包含相同PolⅡ结合量,但免疫沉淀后标本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ结合的染色质)就仅在T等位点有结合,与产生mRNA转录的等位点相对应.结论:成功建立起PolⅡ-ChIP-PE-MS方法,利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量是可靠的,可以利用PolⅡ-ChIP-PE-MS策略鉴定疾病关联基因SNP的功能.

摘要：目的鉴定人肝细胞中雌激素受体α(estrogen receptorα,ESR1)基因启动子使用情况。方法常规培养和刺激HepG2和L02细胞,甲醛固定细胞,超声剪切染色质,采用利用PolⅡ CTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀(PolⅡ-ChIP),针对文献报道的8个可能启动子区设计引物进行PCR扩增,鉴定ESR1基因启动子的使用情况。结果β-雌二醇刺激不同肝细胞后进行PolⅡ-ChIP发现,HepG2肝癌细胞株中ESR1启动子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的结合的片段,而在L02细胞株中则仅启动子D有PolⅡ的结合的片段沉淀出来。结论不同肝细胞中ESR1的表达受不同的启动子的调控。HepG2肝癌细胞株中ESR1的表达受启动子E1、E2、F调控,而在L02细胞株中ESR1的表达受启动子D调控。