摘要：目的利用PCR-RFLP技术扩增7株布氏菌临床分离株16S RNA基因片段,为该菌的分子诊断学、遗传学和流行病学研究提供实验依据。方法参考GenBank公布的布氏菌ATCC 25840标准株序列,设计针对该菌16S RNA保守区的特异性引物,从临床分离培养7株布氏菌,提取DNA并行16S RNA片段的PCR扩增。将PCR产物克隆至PGEM-T载体进行测序并选用合适的限制性内切酶进行RFLP分析,将分析结果用于临床株的同源性及变异位点的研究,并对感染患者的临床资料进行回顾性分析,研究不同布氏菌基因型与感染患者临床特征的相关性。结果利用PCR扩增出的目的片段与预期一致,大小约为1500bp。测序及同源性分析表明,7株临床分离株之间存在98.88%的同源性和11个变异位点。RFLP结果将7株菌分为4个基因型,临床资料回顾性分析患者不同基因型与临床表现之间无明显联系。结论利用PCR技术扩增布氏菌16SRNA基因片段可以实现对该菌的早期诊断,为布氏菌的分子遗传学和流行病学提供依据。

摘要：目的建立运用多重PCR和基因芯片技术一次检测腹泻病粪便同一标本中7种常见致病菌的方法。方法筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的基因,并据此设计引物及探针,制备相应的寡核苷酸芯片,检测了标准菌株,并直接检测腹泻病粪便标本64份。结果以多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,并与基因芯片相应的探针杂交。最低检测菌数为10到100cfu/mL。64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌。其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌。敏感性高于粪便培养方法。结论该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,具有较高的敏感性和特异性,达到了高通量即高效的检测目的,具有较好的实用性。

摘要：目的应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术,建立肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等临床常见病原菌的快速、高效检测方法,并应用于血培养后病原菌的检测。方法以肺炎克雷伯菌khe基因、鲍氏不动杆菌OXA基因、肺炎链球菌LytA基因、屎肠球菌和粪肠球菌ddl基因、大肠埃希菌phoA基因、表皮葡萄球菌2312基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、铜绿假单胞菌ecfX基因、奇异变形杆菌ure基因序列为模板,分别设计特异性引物,建立多重PCR扩增体系并优化。收集临床血培养报阳标本200份,应用所建立的多重PCR法鉴定,并与传统血培养方法比较。结果多重PCR法可特异性扩增出10种病原菌目标DNA条带,200份报阳样本目标菌阳性预测值为60.5%,除传统血培养有1份漏检外,多重PCR与血培养法结果符合率为100%。结论多重PCR方法与传统鉴定方法相比,可大幅度缩短临床培养报阳后鉴定时间,其多种病原菌同时检测的优势,具有良好的临床应用前景。

摘要：目的研究大蒜素与氟康唑体外联合应用对临床分离假丝酵母联合抗菌效应的影响。方法采用棋盘法设计,微量稀释法测定不同浓度组合的大蒜素及大蒜素和氟康唑联合应用分别对65株假丝酵母的最低抑菌浓度,并计算FIC指数,判定联合抗菌效应;用10%的小牛血清-RPMI1640培养基诱导菌丝形成,检测大蒜素与氟康唑联合应用对假丝酵母芽管率和菌丝形成的影响。结果大蒜素与氟康唑联合对假丝酵母的敏感菌株和耐药菌株的MIC50均降低,较单用氟康唑和大蒜素分别降低8倍和5倍(分别为由64μg/mL降至0.25μg/mL、由32μg/mL降至2μg/mL);FIC指数分布:FIC≤0.5占100%,表现为协同作用;大蒜素能加强氟康唑抑制菌丝的形成。结论大蒜素与氟康唑联用后,对假丝酵母表现为协同抗菌作用,能显著提高氟康唑对假丝酵母的杀菌活性。

摘要：目的将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a(+)表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在***中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。方法根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a(+)载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a(+)并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性。结论该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。

摘要：目的探讨基因芯片技术在腹泻病粪便标本常见致病菌检测中的应用。方法筛选7种常见腹泻病致病菌的特异基因作为检测目的基因,分别为志贺菌ipaH基因、沙门菌hilA基因、副溶血弧菌tdh基因、空肠弯曲菌FlaA基因、肠出血性大肠埃希菌stxA2基因、肠产毒性大肠埃希菌st基因、霍乱弧菌ctxA2基因。设计相应的引物及探针,制备寡核苷酸芯片。对多重PCR扩增条件进行优化,将PCR扩增产物与带有7种特异探针的基因芯片杂交。检测标准菌株25株,模拟粪标本及临床腹泻病粪便标本64份。结果经优化多重PCR扩增出7种腹泻病致病菌特异的致病基因片段,与基因芯片特异的探针杂交后,全部产生特异性杂交信号。标准菌株及模拟粪标本检测的阳性和阴性对照符合率均为100%。单一菌株最低检测量为10～100cfu/ml。64份腹泻病粪便标本检测出45份致病菌,其中33份志贺菌、12份副溶血弧菌,检出率为70.3%(45/64)。粪培养检出16份志贺菌,6份副溶血弧菌,检出率为34.4%(22/64),基因芯片法明显优于粪培养方法(P<0.01)。结论该基因芯片直接检测腹泻病致病菌,检出率高,达到了高效的检测目的,具有较好的实用性。

摘要：目的:研究大蒜素与伏立康唑体外联合应用对临床分离的念珠菌联合抗菌效应的影响。方法:用棋盘微量稀释法设计、观察大蒜素与伏立康唑体外联合应用分别对临床分离的69株敏感念珠菌和10株耐药念珠菌的抗菌药物后效应(PAE)和最低抑菌浓度(MIC),并计算分级抑菌浓度(FIC)指数判定联合效应。结果:大蒜素与伏立康唑联合对伏立康唑敏感菌株和耐药菌株的MIC50均降低,联合用药对伏立康唑敏感的念珠菌MIC50的效果比仅用伏立康唑的效果降低了2倍、比仅用大蒜素的效果降低了8倍(分别为由0.06μg/ml降至0.03μg/ml、16μg/ml降至2μg/ml),联合用药对耐伏立康唑的念珠菌MIC50的效果比单独使用伏立康唑的效果降低了2倍、比单独使用大蒜素的效果降低了8倍(分别为由32μg/ml降至4μg/ml、4μg/ml降至0.5μg/ml);FIC指数分布中FIC≤0.5为100%,表现为协同作用。大蒜素和伏立康唑联合应用对敏感念珠菌的PAE为1.3 h,对耐药念珠菌的PAE为1.7h。结论:大蒜素与伏立康唑联合应用对念珠菌表现为协同作用,能显著提高伏立康唑对假丝酵母菌的杀菌活性。

摘要：目的鉴定疑似Ⅱ型猪链球菌血液感染的病原。方法将采集的疑似Ⅱ型猪链球菌血液感染者血液标本注入血培养瓶培养,阳性报警后,转种血平板,5%CO2孵箱培养。同时涂片行革兰染色,API20 strep生化鉴定。16S RNA通用引物PCR扩增,产物经克隆、测序后行Blast比对。针对Ⅱ型猪链球菌型抗原(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外蛋白因子(EF)设计引物,PCR扩增鉴定。结果镜下细菌为革兰阳性球菌,呈短链状或成对排列。API20 strep鉴定编码为4640453:Ⅱ型猪链球菌(ID值92.3%),16S RNA测序结果为猪链球菌,同源性99%以上,3个特异基因均在相应位置出现条带。结论以Ⅱ型猪链球菌三个特异基因为靶基因的PCR方法能够准确快速地鉴定Ⅱ型猪链球菌。

摘要：目的研究肝硬化患者产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌菌血症的危险因素以及影响其预后的相关因素。方法采用病例对照设计,回顾性分析解放军第三○二医院2001—2006年30例大肠埃希菌菌血症肝硬化患者的临床资料,同时选择与阳性患者性别、年龄及培养日期最接近的ESBLs阴性大肠埃希菌菌血症肝硬化患者30例作为病例对照。分析患者初次血培养阳性时的基础疾病、体温、白细胞数及中性粒细胞数、抗生素使用情况、临床合并症、免疫抑制治疗、有创操作、住院时间及培养前、后住院时间等;分析患者菌血症预后与抗生素使用的关系。统计处理采用SPSS10.0软件。均数比较采用Student′st检验;计数资料比较采用Fisher精确检验(双边);如Fisher精确检验相差显著,做比数比和可信区间及M-Hχ2检验;危险因素相关性分析采用逻辑回归分析。结果预用头孢类抗生素是ESBLs阳性大肠埃希菌菌血症肝硬化患者感染独立危险因素(OR=5.675,χ2MH=8.076,P=0.004)。不适当抗生素治疗导致感染预后不好(OR=22.000,χ2MH=6.658,P=0.010)。结论谨慎使用头孢菌素,特别是第三代头孢菌素能够降低产ESBLs大肠埃希菌菌血症的发病率。

摘要：采用L9(34)正交设计,用西藏砂生槐(Sophra moorcroftiana)种子幼苗为外植体,研究NAA、6-BA和IBA不同浓度配比对组培增殖系数的影响,采用田口方法对试验的3个因素及各水平进行S/N值分析。结果表明,用MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA培养基时,西藏砂生槐种子幼苗接种可获得最佳的增殖系数。