摘要：目的利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用Lenti CRISPRv2作为载体构建Lenti CRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒。收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞。提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况。结果 Lenti CRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达。结论通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株。

摘要：目的利用Cumate系统实现APOL1基因在293T细胞内的可诱导稳定表达。方法通过查询NCBI数据库,设计APOL1基因编码区全长引物,克隆至Cumate慢病毒质粒。嘌呤霉素筛选包装慢病毒感染的293T细胞,阳性细胞扩大培养后用不同浓度的Cumate诱导表达,利用Real-time PCR和Western blot验证APOL1的表达情况。结果构建的293T细胞系可被Cumate诱导表达APOL1,且不同浓度的Cumate对细胞表达载脂蛋白L1有不同的影响。Real-time PCR和Western blot均证明在诱导48 h后,随着诱导剂浓度的增加,APOL1表达增多,在Cumate为50μg/ml时APOL1达到最高值。结论成功构建了可诱导表达APOL1基因的293T细胞系,为研究APOL1在EV71感染人体细胞过程中的作用机制提供了稳定的实验材料。

摘要：对于药品生产企业，按照《药品生产质量管理规范》以及药品企业本身生产质量管理的需要，微生物实验室为药企必备的设施硬件之一。微生物检验几乎涵盖了所有药品生产企业的产品，微生物实验数据和检验结论准确与否，直接影响产品质量［1］。中国药典及国际国内有关标准规定按照微生物限度检查法检查国家药品标准中非灭菌制剂及其原料、辅料受污染程度。实验结论直接影响到原料、辅料是否合格可用，非灭菌制剂是否符合相应标准，可上市销售。同时需进行环境监测的生产厂房的环境是否达标有指导意义。这些对于企业来说都非常关键。微生物的检验结果有别于其他的检验项目，它受实验室环境的影响较大。所有药品生产企业应当重视微生物实验室的设计、配置及日常维护的管理，因为其直接影响检验过程及检验结论。药品生产企业应从设计着手为实验室做好硬件设施，建立相关的操作及管理规程，指导人员日常的行为规范、实验室设施设备以及日常消耗品的管理，搞好洁净区的监测和维护，以保证良好的检验环境，提高检验数据的可靠性。