摘要：利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能。设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western blot和细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况。结果显示:成功筛选到2株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(wild type,WT)相比敲除株形成细胞单层的时间明显延长(P<0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染试验表明,模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIF-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加。本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定理论基础。

摘要：利用CRISPR/Cas9技术构建RIG-I基因敲除MDCK细胞株,并验证其生物学功能。试验设计并构建了2个靶向RIG-I基因的导向RNA(sgRNA)表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,采用PAGE胶基因型检测、定点测序和Western blot筛选细胞株;通过荧光定量PCR检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平和病毒基因拷贝数,测定TCID50。结果表明:获得两株稳定敲除RIG-I基因的MDCK细胞(MDCK-RIG-I-/-),Western blot检测RIG-I蛋白不表达;荧光定量PCR结果显示病毒感染后MDCK-RIG-I-/-的MAVS、IRF3、IFN-β、IL-6、Mx1 mRNA表达水平显著降低,表明RIG-I基因敲除后RIG-I-Ⅰ型干扰素信号通路受阻;病毒基因拷贝数、TCID50测定结果显示,差异最高可分别达到野生型MDCK的2.16倍、3.19倍,表明RIG-I基因敲除后流感病毒复制增加。该研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除RIG-I基因流感病毒MDCK细胞株,为研究RIG-I天然免疫应答机制奠定基础;该技术方法和策略也为流感疫苗生产及产业更新换代提供候选细胞株。

摘要：为初步探究鸡TLR4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡TLR4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到TLR4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染TLR4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测TLR4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的TLR4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,TLR4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究TLR4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。

摘要：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。

摘要：TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P<0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P<0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P<0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P<0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P<0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。

摘要：目的探讨自行设计的病员服在预防老年痴呆住院患者走失中的应用效果。方法设计并制作一种老年痴呆症患者专用的病员服,选取神经科2016年7月—2018年6月收治的112例老年痴呆症患者作为对照组,2018年7月—2019年12月收治的86例老年痴呆症患者作为观察组。对照组按神经科老年痴呆症患者护理常规进行护理,观察组在常规护理基础上应用自行设计的专用病员服,比较两组患者住院期间走失发生情况。结果观察组在住院期间走失发生率明显低于对照组,差异有统计学意义(χ^(2)=4.751,P=0.029)。结论专用病员服在老年痴呆症患者中的应用,能提高老年痴呆症患者的人身安全管理,减少走失发生率。