摘要：目的通过构建生存素(survivin)的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人黑素瘤M14细胞生存素表达的抑制作用,为后续研究奠定基础。方法设计有小发夹结构的生存素siRNA对应模板DNA序列,克隆至pRNAT-H1.1/neo质粒,构建重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin,转染人黑素瘤M14细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹检测生存素表达。结果酶切及测序结果证实重组质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin构建成功。将重组质粒及空载体(阴性对照)转染M14细胞48 h后,siRNA处理组M14细胞生存素表达较空白对照组显著下降,表达抑制率在mRNA和蛋白水平分别为62.3%±1.5%和53.6%±0.9%。结论生存素siRNA表达质粒pRNAT-H1.1/neo-survivin可抑制人黑素瘤M14细胞生存素的表达。

摘要：目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(Short Hairpin RNA,shRNA)质粒载体。方法根据文献已发表的BRAF基因序列,设计合成3条BRAF特异性的shRNA编码序列(其中一条shRNA特异性针对黑素瘤中最常见的BRAF V599E错义突变设计)和一条与人基因组无同源性的阴性对照shRNA编码序列。将退火后的双链shRNA编码序列重组于pGenesil-1质粒中,进行双酶切和测序鉴定。结果双酶切显示shRNA编码序列被成功插入pGenesil-1质粒中,测序结果证实插入片断与设计序列完全一致。结论所设计的shRNA编码序列被正确插入质粒骨架,成功构建了BRAF基因序列特异性的shRNA质粒载体。

摘要：目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对人黑素瘤细胞BRAF基因的干扰作用。方法设计2条BRAF基因序列特异性的shRNA编码序列和1条非特异性阴性对照序列,插入质粒pGenesil-1,双酶切和测序鉴定。用构建成功的3条质粒转染人黑素瘤细胞株A375和M14,分别采用RT-PCR和蛋白印迹检测其BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果所设计的shRNA序列被正确插入质粒pGenesil-1。非特异性对照质粒neg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰,2条序列特异性质粒braf 1和braf 2抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达,其中braf 1干扰效果最为明显,最高抑制率可达90%。结论质粒介导的shRNA可成功干扰人黑素瘤细胞BRAF基因的表达,其抑制时间可持续至少1个月。

摘要：目的：研究在存档石蜡包埋皮肤组织标本中提取RNA及进行逆转录PCR的可行性和稳定性。方法：分别抽取1997年、1999～2001年、2004年3个时间段的存档标本各10例，经过蛋白酶K消化后用异硫氰酸-酸性苯酚法提取RNA，设计3对β-Actin不同产物长度的引物，其目的片段的长度分别为445bp、205bp和112bp，比较了以各特异性下游引物及随机引物进行逆转录PCR的结果。结果：随机引物的阳性率很低，产物长度为112bp时很稳定，经卡方检验与另外两个长度间有显著性差异，而各年龄组间无统计学差异。结论：在石蜡包埋组织中提取RNA并进行逆转录PCR，方法稳定，可进行大规模的回顾性研究。

摘要：目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒载体，探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA，构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组，即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组，阴性对照组（阴性对照shRNA转染），空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率；CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力；流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期，Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体，Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明，CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P 〈 0.01）。流式细胞仪检测示，CBLB-shRNA-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%，均P 〈 0.01］。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01），而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01）。Transwell检测示，阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14，差异有统计学意义（F = 794.50，P 〈 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体，其可促进A375细胞凋亡，抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。