摘要：Lysine270是树干毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成结合口袋的关键氨基酸之一.为研究该位点对PsXR辅酶偏好性的影响,用其它19种氨基酸替代Lysine270,构建19种不同的木糖还原酶(XR)突变子,利用同源建模和分子对接的方法评价不同突变子与NAD+或NADP+之间的相互作用,并从中选择突变子K270R和K270N进行实验验证.突变基因及野生基因用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌内进行诱导表达,经纯化后进行酶学性质研究.结果发现:K270R突变使得XR与NADP+的结合能力降低,米氏常数Km由0.025mmol/L升高到0.050mmol/L;K270N突变使得XR与NADP+不能结合.实验结果亦证实,通过理性选择得到的K270N突变子的辅酶依赖性由NADPH完全逆转为NADH.

摘要：木糖代谢过程中,木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的氧化还原不平衡是利用纤维素生成酒精的关键问题之一.文中借助生物信息学手段(同源建模、酶和辅酶分子对接),通过分析数据库资源,找到了一些影响XR活性或辅酶依赖性的关键氨基酸.结果表明:树干毕赤氏酵母XR与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)之间形成氢键的氨基酸有Lys21、Val222、Glu223、Phe236和Thr273,与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)之间形成氢键的氨基酸有Val222、Glu223、Phe236、Glu237和Thr273;突变Lys21(完全保守)使树干毕赤氏酵母XR只与辅酶NAD结合,突变Glu237(不完全保守)使树干毕赤氏酵母XR只与辅酶NADP结合;热带假丝酵母XR与NADP之间形成氢键的氨基酸有Asn278和Arg282(两者都不完全保守),要改变其NADP依赖性,可以替代Asn278和/或Arg282.