摘要：本文简述了某船直升机前牵引绞车移位后对绞车基座下结构进行修改设计及强度计算校核。

摘要：以高效原核表达载体pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(6×His-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点,并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA,将此新质粒命名为pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白,酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-H1 cDNA克隆入pBV223载体中,在大肠杆菌DH5α中成功地表达了Nm23-H1蛋白,通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。

摘要：背景与目的以前的研究已经证明nm23H1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23H1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23H1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23H1S44A、nm23H1P96S、nm23H1H118F、nm23H1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23H1P96SS120G,构建了突变型nm23H1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23H1S44AEGFP、nm23H1P96SEGFP、nm23H1H118FEGFP、nm23H1S120GEGFP、nm23H1P96SS120GEGFP五个突变型nm23H1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23H1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。

摘要：背景与目的Ras to MAPK通路在生长、发育信号传递中起关键的作用。Ras激酶抑制基因(KSR)是该通路中的一个重要组分,其功能主要是作为一个支架蛋白协调装配包含有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其上游调控子的多蛋白复合体。已有的研究表明KSR有许多磷酸化位点,这些位点磷酸化状态的改变与外界信号刺激有着极为密切的关系。利用定点突变技术可以准确地改变基因特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用定点突变技术构建突变型KSR,并将其瞬时转染293T细胞所表达蛋白纯化和鉴定,为进一步研究KSR生化作用机制提供理论和实验依据。方法以本实验室自己构建的pCMV-Tag2b-KSR质粒为模板,应用本实验室改进的QuikChangtm定点突变方法,引入KSR12个突变位点,构建突变型pCMV-Tag2b-KSR,并将其瞬时转染293T细胞进行蛋白表达,亲和胶纯化并经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定。结果成功构建了2个突变型KSR基因,经DNA序列分析突变碱基,证实位点正确,并经过瞬时转染293T细胞表达出突变体蛋白,纯化蛋白经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定与实验设计完全一致。结论成功构建了2个具有不同突变位点的突变型KSR,为以后进行蛋白功能研究提供实验基础。