摘要：目的　了解上海华山医院临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产生的超广谱 β 内酰胺酶 (ESBL)的基因型及其流行情况。方法　双纸片法和美国国家临床实验室标准委员会 (NCCLS)表型确定实验检测产ESBL菌株并对产ESBL菌株进行接合实验 ;提取产ESBL菌株及其转移接合子中的质粒 ,进行电泳分析 ;采用琼脂稀释法 ,测定各种菌株对多种抗菌药物的敏感性 ;TEM、SHV、CTX M 1组、CTX M 13组、Toho 1组通用引物检测产ESBL菌株及其转移接合子 ;编码框以外设计引物、聚合酶链反应 (PCR)扩增转移接合子中的CTX M 13组全编码基因 ,克隆入 pHSG398质粒、表达 ,并对PCR产物进行测序 ,分析其基因型 ;对这些产ESBL菌株进行脉冲场电泳 (PFGE)检测。结果　产ESBL菌株对多种 β 内酰胺类和非 β 内酰胺类抗生素耐药 ;产ESBL菌株可通过接合转移方式传递其耐药性 ,转移频率多为 10 -4～ 10 -5,多数非 β 内酰胺类抗生素的耐药性可以和ESBL耐药性发生共转移 ,琼脂糖电泳显示接合子从供体菌得到了一个 >2 3 1kb的质粒 ;转移接合子中仅CTX M 13组通用引物检测为阳性 ;4株转移接合子中CTX M 13组全编码基因序列与CTX M 14编码基因序列的同源性为 10 0 % ,其余 6株转移接合子中CTX M 13组全编码基因序列与CTX M 2

摘要：目的　了解华山医院临床分离的肺炎克雷伯氏菌K99 10 2 9菌株产生的超广谱 β 内酰胺酶(ESBLs)的基因型。方法　编码框以外设计引物、PCR扩增K99 10 2 9转移接合子中的ESBLs全编码基因 ,克隆入pHSG398质粒、表达 ,并对PCR产物进行测序分析其基因型。结果　K99 10 2 9转移接合子所产生的三种酶编码基因序列分别与GenBank中TEM 1、SHV 12、CTX M 3编码基因序列的同源性为 10 0 % ;产SHV 12或CTX M 3克隆菌株对多数 β 内酰胺类抗生素耐药 ,SHV 12和CTX M 3对多数 β 内酰胺类抗生素具有水解作用 ,CTX M 3对头孢噻肟的水解能力明显强于头孢他啶 ;产TEM 1克隆菌株仅对青霉素类耐药 ,TEM 1对青霉素类有明显的水解作用。结论　临床分离的肺炎克雷伯氏菌K 99 10 2 9菌株同时产生TEM 1、SHV 12、CTX M 3型酶 ,可导致对大多数的 β 内酰胺类抗生素产生耐药性。

摘要：目的通过临床常见致病菌23SrRNA基因序列差异的分析,探索建立可同时检测或鉴定多种细菌的分子生物学方法。方法对常见致病菌23SrRNA基因的一个多变区序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增和测序分析,根据序列差异设计相应引物和探针,并采用PCR凝胶电泳分析和PCR反向杂交技术检测或鉴定临床常见致病菌。结果1.革兰阳性菌和革兰阴性菌间的23SrRNA基因序列存在较大差异,通过PCR扩增和凝胶电泳分析能快速区分待测菌株为革兰阳性菌抑或革兰阴性菌;2.不同菌种间亦存在一定差异,可通过PCR反向杂交技术将细菌鉴定到种。结论临床常见致病菌的23SrRNA基因之间存在可供细菌鉴定的序列差异,据此可望建立各种具有快速、灵敏、准确特点的分子生物学方法,为细菌感染的快速病原诊断提供客观依据。

摘要：目的　建立基于 2 3SrRNA基因的一种常见病原菌菌种鉴定的分子生物学方法。　方法　使用地高辛标记的通用引物扩增常见病原菌的 2 3SrRNA基因 ,并在尼龙膜上固定根据扩增产物序列设计的菌种特异性探针 ,根据反向杂交结果判断病原菌种类。选取临床分离获得的菌株验证该方法的有效性。结果　通用引物可特异性扩增细菌 2 3SrRNA。应用该方法可鉴定金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、绿脓假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌。检测临床标本结果显示 ,与常规培养方法的符合率为 99%。结论　该方法可用于常见病原菌的鉴定。

摘要：目的通过分析肺炎链球菌PBP2b基因转肽酶编码区的序列差异,建立可区分对青霉素敏感肺炎链球菌(PSSP)与青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSSP)的分子生物学方法。方法检测青霉素对肺炎链球菌的最低抑菌浓度(MIC),对菌株PBP2b转肽酶编码区进行PCR扩增和序列分析,根据序列差异设计相应引物和探针,并采用PCR-反向杂交方法区分PSSP与PNSSP。结果43株肺炎链球菌(42株临床分离株及1株标准株)中8株为PSSP,30株为青霉素中介株(PISP),5株为青霉素耐药株(PRSP)。经PBP2b基因限制性片段长度多态性分析(RFLP)及测序分析,PSSP与PNSSP (PISP+PRSP)存在谱型及序列差异。根据序列差异建立的检测方法可正确区分PSSP与PNSSP。结论肺炎链球菌PSSP和PNSSP菌株的PBP2b基因转肽酶编码区之间存在可供鉴别的序列差异,据此可建立快速、特异的分子生物学方法,有望为该菌耐药基因的快速诊断提供客观依据。

摘要：目的　根据临床常见致病菌 2 3SrRNA基因序列的差异 ,建立可初步鉴别革兰阴性菌和革兰阳性菌的分子生物学方法。方法　分析常见细菌的 2 3SrRNA基因序列 ,设计相应引物。采用多重PCR扩增标准菌株及临床分离株 2 3SrRNA基因 ,并根据电泳结果作出初步分类。结果　革兰阴性菌株均出现 1条DNA电泳条带(约为 35 0bp) ,而革兰阳性菌株则出现 2条电泳条带 (约为 2 5 0和 4 0 0bp)。 6 0株临床分离菌经PCR扩增、电泳后 ,电泳分析结果与常规鉴定结果符合率达 10 0 %。结论　 2 3SrRNA基因检测用于细菌初步分类鉴定 ,具有快速、灵敏、准确的特点 。

摘要：目的 :了解复旦大学附属华山医院临床分离产超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs)大肠埃希菌中SHV型 β内酰胺酶的分布、流行情况以及分子生物学特点。方法 :用SHV型 β内酰胺酶基因的通用引物进行聚合酶链反应 (PCR)检测 ;编码框以外设计引物、PCR扩增SHV型 β内酰胺酶全编码基因并进行克隆表达、序列分析 ;对产SHV型 β内酰胺酶的菌株进行脉冲场凝胶电泳 (PFGE)检测。结果 :5 8株产ESBLs大肠埃希菌中 ,只有 3株细菌产生SHV型 β内酰胺酶 (5 .2 % ) ,其中 1株产生SHV 1 1(非ESBLs) ,另 2株产生SHV 1 2 (ESBLs) ;3株产SHV型 β内酰胺酶菌株的PFGE谱型不同。 结论 :临床分离产ESBLs大肠埃希菌中 ,SHV型 β内酰胺酶的基因型为SHV 1 1和SHV 1 2 ,SHV型ESBLs不是主要的ESBLs型别。未发现产SHV型

摘要：目的建立细菌感染患者早期病原及耐药性分子诊断技术,以便尽早实施有效的抗感染治疗方案,改善患者预后。方法扩增细菌23S rRNA基因序列,同时扩增多种耐药基因,设计探针,通过基因芯片杂交技术识别其差异序列,鉴别细菌,检测耐药基因,用于病原早期诊断和耐药谱测定;收集血培养标本223份,脑脊液、胸水、腹水标本339份,尿液标本514份,比较所建立方法与传统方法的一致性,验证所建立技术的可靠性。结果基因诊断方法可正确检出常见病原菌,并检测其是否携带mecA、SHV、CTX-M-1组和CTX-M-2组耐药基因。检测血、尿及脑脊液等无菌体液标本时,所建立的快速检测方法与常规方法的符合率分别为96.4%、99.8%和99.7%,总体符合率为99.1%,耐药性检测与传统药物敏感结果的符合率为95.7%,其准确性与常规方法相当,检测时间比常规方法平均减少(2.09±1.15)d。结论多重PCR-基因芯片杂交技术可用于耐药菌感染的病原早期诊断和耐药感染的同步检测,应用于临床可望改善患者的预后。

摘要：目的 建立基于CycleavePCR技术的肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变株快速检测方法.方法 收集102株分离自2005-2008年上海市交通大学附属儿童医院住院患儿的肺炎支原体及136份2009年11-12月上海市交通大学附属儿童医院呼吸道感染的住院患儿经鼻采集鼻咽部痰标本,根据肺炎支原体无突变敏感株与突变耐药株23S rRNA基因2063/2064位的碱基差异及上下游保守序列分别设计新型特异性探针（Cycling探针）及引物,建立肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变株检测方法,以含有被检测靶序列的重组质粒为阳性对照,以常见呼吸道病原菌DNA为阴性对照,评价其敏感度及特异度.采用自建方法检测所有标本,并与常规PCR及测序结果比较.结果 该方法可准确检出并鉴别大环内酯类敏感及耐药突变株阳性对照,102株临床分离株中83株对大环内酯类耐药,测序表明82株发生23S rRNA基因A2063G突变,1株A2064G突变,与CycleavePCR检测结果相符,136份痰标本检测结果也与常规PCR扩增及测序结果相符.所有阴性对照样品均未出现假阳性.与常规PCR及测序方法相比,CycleavePCR法的敏感度和特异度均达100%.该方法的检测下限为10拷贝/PCR反应,扩增检测可在1.5 h内完成.结论 建立了一种基于CycleavePCR技术的肺炎支原体及其大环内酯类耐药突变株快速检测方法,可同步提供病原菌及其耐药性信息,为肺炎支原体感染诊断及临床合理选用抗菌药物提供参考.

摘要：目的研究中国健康受试者单剂或多剂口服西他沙星(DU-6859a)片剂后的药动学(PK)及PK/药效学(PD)。方法单剂给药组:单中心、开放、3个剂量组平行研究设计。每个剂量组入选12名受试者,分别单剂空腹口服西他沙星片50mg、100mg和200mg;多剂给药组:单中心、开放、单个剂量组研究设计。共入组12名受试者,口服西他沙星片100mg,1次/12h,连续给药10d,其中第1天和第10天仅早晨给药1次。收集受试者给药后的血样和尿样,采用经过方法学验证的超高效液相色谱-串联质谱方法(UPLC-MS/MS)测定血清及尿液样本中西他沙星浓度,并结合西他沙星对社区获得性肺炎(CAP)和尿路感染(UTI)常见病原菌的体外PD结果(MIC)进行PK/PD分析。结果受试者单剂口服西他沙星片50mg、100mg和200mg后,分别于0.92h、1.42h和1.21h达到高峰血清浓度(C_(max)),C_(max)分别为(0.72±0.19)mg/L、(1.39±0.36)mg/L和(2.32±0.78)mg/L,平均药时曲线下面积(AUC_(0-∞))分别为(3.67±0.67)mg·h/L、(8.19±1.15)mg·h/L和(14.20±3.21)mg·h/L,消除半衰期(T_(1/2))分别为(6.55±0.97)h、(6.84±1.17)h和(7.81±0.89)h。给药后48h内平均累积尿排出率在61.4%~70.0%。多剂给药后第1天和第10天血C_(max)分别为(1.01±0.19)mg/L和(1.26±0.20)mg/L,第10天达到稳态后,AUC_(0-12h(ss))为(6.88±0.81)mg·h/L,稳态时总清除率(CL_(ss)/F)、总清除率(CL_r/F)分别为(14.72±1.79)L/h和(10.58±1.40)L/h,达峰时间(T_(max))和表观分布容积V_(dz)/F分别为(2.08±0.76)h和(128.95±24.86)L。蓄积因子(R_(AUC))为1.35。第1天和第10天48h的药物平均累积尿排出率分别为67.64%和99.11%。体外PD结果提示西他沙星抗菌活性可覆盖CAP和UTI的主要病原菌,西他沙星对CAP患者中肺炎链球菌PK/PD参数可达到其靶值,给药后尿药浓度高,即使8~12h尿药浓度仍可维持在大肠埃希菌MIC_(90)至少5倍以上。结论健康受试者单剂和多剂口服西他沙星片后吸收迅速,在50~200mg剂量范围内呈线性PK特征,受试者耐受性良好。西他沙星片100mg2次/d的给药方案对CAP和UTI常见病原菌所致感染预期可达到良好的临床疗效和微生物学疗效。