摘要：工业生物技术是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。本期专刊结合第七届中国工业生物技术发展高峰论坛,报道了我国工业生物技术领域专家学者在生物信息学、微生物细胞工厂的模拟设计与构建、工业发酵工程、工业酶的改造与应用、高通量筛选方法等领域取得的最新研究进展。

摘要：烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.

摘要：为提高重组大肠杆菌中顺丁烯二酸异构酶表达量,通过正交试验设计,对工程菌的生长条件和目的蛋白可溶表达条件进行优化.采用250 mL三角瓶中装有50 mL(Amp 100 mg L-1)的培养基,分别研究培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉的浓度,培养基pH值以及摇床转速、装液量、接种量等对蛋白可溶表达量的影响.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌最优化培养基为:蛋白胨20 g L-1、酵母浸粉2.5 g L-1、K2HPO4·3H2O 3.0 g L-1、KH2PO4 1.5 g L-1、NaCl 6 g L-1、MgSO43 g L-1,培养基pH调至6.5.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌可溶性表达最优条件为:37℃下培养至D600 nm值为1.0时,添加终浓度为0.05 mmol L-1的IPTG进行诱导,诱导温度37℃,摇床转速220 r min-1,装液量20%,接种量5%,诱导时长为6 h.利用BioFlo 415发酵罐以最优化的培养基和发酵条件对该工程菌进行了3批发酵实验,与摇瓶实验相比,顺丁烯二酸异构酶的表达量提高了近1.5倍,单位发酵液的酶活力由46 U mL-1发酵液提高到78 U mL-1发酵液.以上数据为顺丁烯二酸异构酶重组工程菌的中试发酵奠定了基础.

摘要：7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体,利用头孢菌素C酰化酶直接催化头孢菌素C获得7-氨基头孢烷酸的一步酶法与其它方法相比更加经济和环保,其关键是获得高活性的头孢菌素C酰化酶.本文以来源于Pseudomonas ***-1的Ⅰ类头孢菌素C酰化酶(CPCase-kac)蛋白序列为模版,对其基因进行全局优化设计,人工合成目的基因,并克隆至表达载体p ET28b,实现了CPCase-kac的高效表达.但是重组蛋白CPCase-kac表达活性较低,且自剪切不彻底,表达蛋白中存在前体形式的CPCase-kac,而头孢菌素C酰化酶的自剪切和活性往往相关.对CPCase-kac分子中影响活性的Y150、Q220、F347氨基酸位点进行饱和突变发现,活力提高的突变体Q220W、Q220G其第二次自剪切明显降低,而活力提高的突变体Y150R、Y150N、Y150H、Y150W及F347H、F347Y,自剪切却没有显著影响.将这些突变进行组合,最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体Y150W/Q220G/F347Y.虽然Y150W/Q220G/F347Y突变体活性显著提高,但是其也具有Q220G较差的第二次剪切的特性.同时发现,外部条件改变可以影响CPCase前体或α’亚基的继续自剪切.这些发现为进一步提高CPCase-kac活性及应用打下了基础.

摘要：手性醇是一类非常重要的化合物,羰基还原酶催化酮的不对称还原生成对应的手性醇。从毕赤酵母Pichia pastoris GS115基因组数据中找到一个潜在的NADPH依赖的羰基还原酶,研究毕赤酵母***115中的羰基还原酶。根据其核酸序列设计引物,从*** GS115基因组中扩增到目的基因ppcr,大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA纯化,对酶的性质和底物谱进行了研究。PPCR的最适反应温度为35℃,最适反应pH为6.0,低于45℃时有很好的稳定性。对3-甲基-2-羰基丁酸乙酯的Km和kcat分别为9.48 mmol/L和0.12 s-1。PPCR表现出广泛的底物谱和很高的对映选择性,对醛、α-酮酯、芳香族β-酮酯及芳香族酮都表现出了很好的活性,在测定的底物中,除极少数底物外,ee值均达到97%以上。因此,PPCR具有较好的应用前景。