摘要：将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL^(-1),且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。

摘要：为快速检测禽白血病病毒(avian leukemia virus,ALV)并同时鉴别A亚群(ALV-A)和J亚群(ALV-J),根据ALV不同亚群基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立通用型、A亚群与J亚群三重PCR以及A亚群与J亚群双重荧光探针检测方法。结果显示:三重PCR检测方法能特异性扩增ALV所有亚群以及A亚群和J亚群,检测灵敏度达1×103拷贝/μL;建立的ALV-A/J双重荧光探针检测方法特异性强,可检测的最低拷贝浓度为40拷贝/μL。本研究建立的三重PCR方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒均有较高的符合率(Kappa系数>0.75);针对24份发病鸡精液,ALV-A/J双重荧光探针检测方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒检测结果一致;本研究建立的两种检测方法均能同时鉴别出ALV A亚群和J亚群。利用本研究建立方法对安徽省394份临床样本进行检测,发现ALV总阳性率为38.58%,以J亚群单一感染为主,同时伴有A亚群单一感染以及A/J亚群混合感染。结果表明,本研究建立的ALV-通用型/A亚群/J亚群三重PCR方法和ALV-A/J亚群双重荧光探针检测方法特异性强,检测快速,具有临床样本检测的应用潜力,为临床上快速诊断及有效防控ALV感染及鉴别A/J亚群的单一或混合感染提供了技术支持。

摘要：为快速鉴别诊断高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病,根据GenBank中登录的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Nsp2基因缺失区和猪伪狂犬病病毒(PRV)gB基因保守区序列,分别设计并合成了2对特异性扩增引物,通过对反应条件的优化,建立了能够同时检测HP-PRRSV和PRV的双重PCR诊断方法。利用建立的双重PCR方法对30份临床可疑样品进行检测,并与商品化单项PCR试剂盒进行对比验证。结果表明,本试验建立的双重PCR方法具有较高的灵敏度和特异性,与商品化单项PCR试剂盒检测结果完全一致。因此,该双重PCR方法能够用于HP-PRRSV和PRV单项或混合感染的临床样品快速鉴别检测。

摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株(ATCCVR-2332)的ORF7保守序列和猪圆环病毒2型(PCV-2)(AF381175)的ORF2基因保守序列,设计合成了两对特异性引物。用这两对引物,通过优化的PCR条件,对PRRSV阳性毒株反转录后的cDNA模板和PCV-2毒株的DNA模板进行双重PCR扩增,同时得到两条与试验设计相符的432bp(PRRSV)和630bp(PCV-2)特异性条带,建立了同时检测PRRSV和PCV-2的双重PCR方法。并用此方法对在安徽省不同地区所采集的72头份病猪的淋巴结、肺、肝、脾、肾等组织进行检测,证明建立的PCR方法可用于临床诊断。

摘要：参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对猪伪狂犬病病毒安徽分离株的gE基因进行PCR扩增和序列分析,扩增的目的片段大小为632 bp。应用DNAStar软件对gE基因序列核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分析并绘制遗传进化树。结果表明,猪伪狂犬病病毒安徽分离株之间的核苷酸同源性分别为96.8%～99.7%,氨基酸序列同源性为97.9%～100.0%,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株的核苷酸同源性为97.0%～99.7%,氨基酸序列同源性为97.4%～100.0%。进化树分析表明,安徽分离株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。