摘要：目的:构建心肌细胞特异性过表达miR-19b的转基因小鼠,并对其进行表型分析。方法:先确定载体插入的酶切位点,根据CloneEZRPCR Cloning Kit重组原理设计相应引物,以小鼠基因组为模板克隆出带有miR-19b前体序列(pre-miR-19b)的目的片段,利用重组酶连接到带有alpha-MHC启动子的载体上。将所得载体线性化后,采用显微注射方法注射到小鼠胚胎干细胞内。再将所得的重组胚胎干细胞移植入假孕的C57BL/6J雌鼠子宫内,在所得的子代,即Founder小鼠中采用特异的引物鉴定出转基因小鼠,并选出相应的品系,进行表型分析。结果:成功构建miR-19b转基因小鼠,且miR-19b转基因小鼠舒张期室间隔厚度、舒张期左室游离壁厚度以及射血分数均有升高。结论:心肌特异性过表达miR-19b可以导致心脏肥大。

摘要：目的构建鼠miR-20b慢病毒表达载体,检测其在P19细胞中的过表达效果。方法设计并合成含有miR-20b成熟序列的编码短发卡状RNA(shRNA)的双链DNA。将shRNA克隆入慢病毒载体,与Pcgvp、Rev和Vsvg包装质粒共转染HEK-293T细胞包装病毒,收取病毒上清液,纯化后感染P19细胞。荧光倒置显微镜下观察感染效率,实时定量PCR检测慢病毒感染后miR-20b的相对表达量。结果经双酶切分析及测序验证,成功构建了miR-20b的过表达载体。慢病毒感染P19细胞的效率可达到70%以上,miR-20b表达水平明显升高。结论成功构建了鼠miR-20b的慢病毒表达载体,包被的病毒可以在P19细胞中实现过表达效果。

摘要：目的观察芳香烃受体(AHR)基因沉默后对P19细胞向心肌分化进程中WNT信号通路的影响。方法根据小鼠AHR基因序列设计并构建AHR基因的shRNA真核表达载体,将AHR干扰质粒转染至P19细胞,通过G418筛选出稳定的AHR基因沉默表达的阳性细胞株,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测P19细胞分化过程中WNT信号通路中关键基因GSK3β、β-catenin mRNA的表达水平。结果构建的AHR-shRNA表达质粒能显著抑制AHR基因的表达;随着P19细胞向心肌细胞分化,实验组β-catenin基因的相对表达量低于对照组,而GSK3β基因的相对表达量则高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论干扰AHR基因表达对心脏发育过程中WNT信号通路产生调节作用。