摘要：目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（RifampicinResistartceDeterminingReglon，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，53ITCG和531TrG）．应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较．部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中．其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份哺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株．其中利福平耐药株48份．荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到53l密码子突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变．3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子．TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为I晦床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。

摘要：爱情是个古老而常新的话题，古往今来有不计其数的文学、艺术和哲学作品表现和诠释爱情。爱情无处不在，而爱情观又日益多元，爱情教育因而也存在着内容广泛、形式多样、方法泛化、效果难以检验等特点，这些特点也决定了对中学生进行爱情教育的现实性和必要性。

摘要：地点:印度Chennai结核病研究中心。目的:利用表型和基因型方法快速鉴定耐多药结核分枝杆菌。设计:对两种基因型分析方法,即 DNA测序法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)法和一种表型分析方法,即噬菌体生物增殖法(phaB)进行了实验室内的标准化,并利用这三种方法测定101株RFPr和100株RFPs临床分离结核分枝杆菌 的利福平耐药性。结果和结论:将三种方法的检测结果与常规间接药敏实验进行比较。DNA测序法的灵敏度和特异度分别为97％和100％,PCR-SSCP法为76％和100％,而phaB实验为97％和84％。DNA测序法的灵敏度和特异度高于其它两种方法。

摘要：目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。

摘要：目的研究原核类泛素（Pup）-蛋白酶体系统对分枝杆菌生长活力的影响。方法分别敲除耻垢分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统中pup和蛋白酶体β亚基基因（prcβ）。选取待敲除基因的上下游侧翼序列设计引物，构建自杀性载体，靶基因同源序列和菌株基因组发生同源重组后获得基因敲除的菌株。分别连续测定野生型和基因敲除株在正常及低氧和厌氧应激培养条件下的吸光度值，比较菌株生长活力的变化。结果正确构建敲除pup和prcB基因的突变株，分别命名为△SM-Pup和△SM—prcB。△SM-Pup菌株生长速度快于野生型菌株和△SM-prcB株。prcB基因的敲除对细菌的生长活力没有产生明显的影响。结论Pup-蛋白酶体系统对耻垢分枝杆菌的生长产生了一定作用，但具体机制仍需要进一步研究探讨。

摘要：目的体外构建表达原核类泛索蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础，为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体，为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段，扩增富集***片段，从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增Pup片段；应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和PUP片段依次连接到载体上，构建带双标签的原核表达载体pET28a—his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep—Pup表达载体，经酶切和聚合酶链反应验证，分别导人大肠杆菌（***）和耻垢分枝杆菌（***）中，鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株，超声破碎离心收集上清和沉淀，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）电泳，用免疫印迹法（Western blot）验证标签蛋白在***和***中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序，证实成功构建了双标签Pup表达载体并导人目的菌株，诱导后蛋白表达，Western blot结果表明标签蛋白在***和***中均可得到正确表达，在***中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达***蛋白的双标签重组载体，可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析，为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。

摘要：目的结核分枝杆菌（***）潜伏感染状态是造成结核病诊断和研究的难点之一，目前的检测方法很难将潜伏感染结核病（LTBI）和活动性结核病（ATB）区分开。有文献报道分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）和小分子热休克晶体蛋白（Acr）两个基因在***持留状态下高表达，因此可能和菌的潜伏感染相关，有作为新的诊断靶标的可能，因此我们对它们开展了有关的研究和应用，以期为LTBI的诊断提供新的研究方向和方法。方法首先针对目的基因设计引物，从基因组上扩增其全序列，构建克隆和表达载体，纯化分离蛋白。将蛋白作为抗原应用于免疫学的检测，用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中两种蛋白抗体的表达水平，最终经过统计学处理，分析LTBI和ATB患者之间的血清学的差异，寻找可应用于l晒床诊断分析的方法和策略。结果成功构建PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体，并获得表达和纯化的蛋白。血清的PcaA和Acr抗体水平检测结果显示健康对照（HC）与ATB之间差异有统计学意义，而ATB和LTBI之间差异并无统计学意义，即使将两个蛋白检测结果进行并联分析后也未显示差异有统计学意义。结论PcaA和Acr蛋白可以在大肠杆菌中成功表达并顺利纯化，PcaA蛋白有较高的抗原特异性和免疫反应性，可用于以后对结核病的检测分析中；虽然用血清学诊断时不能完整的区分LTBI和ATB，但可用于鉴别结核分枝杆菌感染与否。

摘要：目的建立一种聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)联合CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a识别靶基因核酸序列对结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid,MTB DNA)进行检测的方法。方法将MTB保守序列IS6110片段插入pMD^(TM)19-Tsimple Vector克隆载体,构建含待检测靶序列的模拟MTB质粒。同时针对待检测靶序列MTB保守序列IS6110设计可以检测MTB DNA的3条不同的特异性规律成簇间隔短回文重复序列RNA(CRISPR RNA,crRNA)探针(IS6110-lcrRNA、IS6110-2crRNA、IS6110-3crRNA),引导CRISPR-Cas13a识别转录产物。将筛选出的特异性crRNA、不同待检测标本的PCR扩增转录产物、Cas13a、crRNA和Background RNA等按比例混合构建PCR-CRISPR反应体系。利用荧光定量PCR仪对含有MTB DNA不同稀释浓度的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行检测。通过测定的相对荧光强度值分析检测的敏感度及特异度,最终建立基于MTB CRISPR-Cas13a系统的PCR-CRISPR检测方法。结果选择相对荧光强度值最大的IS6110-lcrRNA[相对荧光强度值为197680.64(98364.94,304271.25)]作为后续MTB DNA检测的crRNA探针。PCR-CRISPR检测最低拷贝数为10^(1)拷贝/μl的质粒和10^(0)拷贝/μl的H37Rv扩增产物的相对荧光强度值[分别为38655.34(31975.51,45410.32)和17691.50(17612.36,17793.29)]明显高于阴性对照[29989.48(29435.72,30263.20)和13725.83(13652.43,13804.95)](Z=-6.713、-9.448;P值均<0.001),显示敏感度较好;阴性对照[37635.57(37168.74,38199.20)]和戈登分枝杆菌[39351.83(38903.70,39769.53)]、胞内分枝杆菌[39191.30(39018.51,39434.95)]、堪萨斯分枝杆菌[25172.20(24586.95,26046.45)]、脓肿分枝杆菌[37328.03(36959.01,37546.78)]、鸟分枝杆菌[37942.29(37455.63,38401.13)]、偶发分枝杆菌[29491.19(29148.63,30058.62)]等6种非结核分枝杆菌的相对荧光强度值均明显低于10^(6)拷贝/μl的MTE DNA质粒的相对荧光强度值[89204.07(66253.60,108819.13)](Z值均9.448,P值均<0.001),显示特异度良好。结论首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术,具有敏感度及特异度高、稳定性好、成本低等特点,有望进一步用于临床样本的检测。