摘要：目的基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性,建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检测技术。方法参照新型冠状病毒的基因序列,利用生信技术筛选并设计合成多个新型冠状病毒特异的crRNA(CRISPR RNA),以体外转录的通用ssRNA(单链RNA)靶标建立检测技术并优化检测体系,以新型冠状病毒假病毒核酸标准物来评价方法检测限。收集临床样本,其中阳性样本应包含不同的新型冠状病毒变异株,阴性样本包括其他的常见呼吸道病原体(甲型流感病毒/乙型流感病毒、人类副流感病毒、肺炎克雷伯菌等)临床样本。分别用实时荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR及本研究建立的免扩增可视化快速检测技术,对各种样本进行检测,分析评价新建立技术的灵敏度和特异度。采用四格表确切概率法针对荧光定量PCR、数字PCR与本技术检测结果进行统计学分析,采用双侧检验,P<0.01为差异有统计学意义。结果本研究设计合成了10条crRNA,用于基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术的建立与优化,本技术可在最短6 min内检出新型冠状病毒的核酸。利用新型冠状病毒假病毒核酸标准物评价该技术的检测限,结果显示仪器辅助下本技术检测限为14拷贝/μl,肉眼下检测限为28拷贝/μl。以qPCR和数字PCR确认的113份临床样本对所建立的检测技术进行敏感度和特异度分析,利用相关公式及SPSS22软件计算分析,该检测技术的敏感度98.5%(66/67),特异度100%(46/46),本研究建立的基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒免扩增可视化快速检测技术检测结果与金标准qPCR检测结果差异无统计学意义(P=1)。结论本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术,该技术流程简单、操作便捷,对操作环境要求低,检测限接近qPCR,有较强的现场检测应用潜力。

摘要：新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染人体后可引起发热、咳嗽等呼吸道症状,重症者可发生新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)、严重急性呼吸综合征、甚至死亡。目前针对新型冠状病毒的感染无特效治疗药物,主要依靠疫苗接种来阻断其传播。在新型冠状病毒的结构蛋白中,刺突蛋白(Spike,S)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)是其主要的抗原蛋白,也是制备新型冠状病毒疫苗和研发抗体检测试剂的重要候选蛋白。使用原核表达系统表达重组新型冠状病毒抗原表位融合蛋白,并对其免疫原性进行验证。本研究通过分析筛选出新型冠状病毒结构蛋白S1、N及E蛋白的抗原表位,将筛选出的含强抗原表位的片段串联成融合蛋白,利用基因工程技术构建了表达融合蛋白的工程菌,纯化复性后获得了可溶性的融合蛋白。不同剂量的融合蛋白配伍不同的佐剂后进行小鼠免疫实验,通过检测抗血清的效价及相关细胞因子的水平,评价融合蛋白诱导的体液免疫和细胞免疫效果。设计的融合蛋白以包涵体的形式表达,经透析复性后得到可溶性的融合蛋白;小鼠免疫后产生了高效价的特异性抗体,并引起了较强的细胞免疫;高浓度的融合蛋白产生的免疫效果优于低浓度的融合蛋白;MF59佐剂诱导的免疫效果与铝佐剂无显著差别。本研究为新型冠状病毒融合蛋白的设计拓宽了思路,研制的融合蛋白有望用于新冠病毒重组蛋白疫苗及诊断试剂的研发。

摘要：为了实现海缆埋设机探测器数据远距离稳定传输、数据存储与管理、数据可视化显示等功能。利用Qt跨平台的C++图形化界面应用程序开发框架,设计了一款海缆埋设机探测器的上位机软件。采用UDP网络通信的方式实现与探测器设备的通信连接,获取探测器中所有传感器信息,将这些数据传输至上位机软件。通过软件对获取的数据信息进行数据解析处理、可视化管理和数据存储等,通过观察软件显示界面可判断海缆的准确位置。经实际测试及应用结果表明,设计的上位机软件提高了数据传输的稳定性和数据采集效率,界面简洁易用,工作稳定性高。

摘要：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是重要条件致病菌之一,它是社区获得性和院内感染相关的重要病原体,可导致肺炎、尿路感染、败血症、肝脓肿等。目前KP多重耐药问题严峻,开发疫苗预防其感染尤为必要。外膜蛋白是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子之一,OMPA、OMPN、CusC富含大量保守区,是研制KP疫苗的理想候选蛋白。该研究通过原核系统表达重组肺炎克雷伯菌抗原表位融合蛋白,并对其免疫原性进行验证。通过计算机分析筛选出KP外膜蛋白OMPA、OMPN、CusC高度保守的抗原表位,将多个表位串联成融合蛋白,构建大肠杆菌重组系统表达KP融合蛋白,用镍离子螯合层析技术纯化目的蛋白,蛋白配伍不同的佐剂分组免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价及相关细胞因子水平以评价融合蛋白诱导的体液免疫和细胞免疫效果,对比各组之间免疫效果的差异,筛选最佳免疫方案。表达出的重组融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经变复性处理后得到可溶性的融合蛋白;重组融合蛋白免疫小鼠后产生了高效价特异性抗体,搭配佐剂可以提高抗体效价,其中MF59佐剂和CpG佐剂增强作用最好,其次是铝佐剂;免疫后的小鼠可产生细胞免疫,搭配佐剂可以提高细胞免疫的效果,其中MF59佐剂的促进作用最优,其次是CpG佐剂,再者是铝佐剂。本研究设计的肺炎克雷伯菌融合蛋白具有良好的免疫原性,能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,搭配佐剂可显著增强免疫效果,为亚单位疫苗的研制奠定了基础。

摘要：新型冠状病毒感染人体后可引起发热、咳嗽等呼吸道症状,重症者可发生新型冠状病毒肺炎、严重急性呼吸综合征、甚至死亡。因此,快速、准确的识别新冠病毒的感染者,对于阻止病毒的持续传播非常重要。目前,新冠病毒抗原检测试剂产品大多以单个新冠病毒的N蛋白为目标抗原,存在一定的假阴性情况,本研究使用可识别多个新冠病毒结构蛋白抗原表位的多抗建立了一种双抗夹心ELISA方法,有望提高新冠病毒抗原检测的敏感性。利用课题组前期设计的一种新冠病毒抗原表位融合蛋白作为免疫原,搭配弗氏佐剂免疫新西兰大白兔,分析兔血清抗体的分泌情况及效价。利用制备的兔源多抗作为捕获抗体,以HRP标记的兔源多抗作为酶标抗体,建立一种用于检测新冠病毒抗原的双抗夹心ELISA检测方法。分别确定最佳捕获抗体、酶标抗体的稀释度以及最佳封闭液种类、封闭时间,初步评价方法的灵敏度和特异性,并比较不同样品储存条件对该ELISA方法检测效果的影响。新冠病毒抗原表位融合蛋白免疫兔后产生了高效价的特异性抗体,经纯化获得了相应的多抗。所建立的双抗夹心ELISA方法具有较好的检测限和线性范围,与常见的呼吸道病原体无交叉反应,有望用于新冠病毒的抗原检测。

摘要：目的建立一种快速、灵敏、特异的SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法,以期用于检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型。方法根据3种病毒vp1基因保守序列设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠrRT-PCR方法。分别构建3种病毒的vp1部分基因的重组质粒作为病毒的体外转录标准品,分别以100~109和102~105倍稀释的标准品、其他6种肠道病毒、两种呼吸道RNA病毒及以临床诊断为手足口病的临床标本为模板,经过优化SYBR GreenⅠrRT-PCR反应条件,建立标准曲线和溶解曲线对其灵敏度、重复性、特异性进行评价,分析其临床应用中的效果。结果成功建立了3种柯萨奇病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量rRT-PCR方法及定量标准曲线,方法的灵敏度为101copies/μl质粒标准品,变异系数均<2%,与柯萨奇病毒A组6、10、16型,肠道病毒EV71型,诺如病毒,轮状病毒,麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应。检测84份手足口病临床标本,阳性率分别为36.9%(CVA4)、8.33%(CVA5)和7.14%(CVA2),经测序验证符合率为100%。结论建立的检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型的SYBR GreenⅠrRT-PCR方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可用于手足口病病原体的分型检测。

摘要：物资采购作为EPC项目管理实施的重要环节,贯穿着设计、施工、运维等多个项目运行阶段。既是承托项目执行始终的基本要素,顺利推进的可靠保障,也是实现项目盈利,按期交付的有力支持。因此,不断提高EPC项目采办管理水平,对于EPC项目管理意义重大。本文从进度管理、索赔管理和沟通管理三方面入手,分析了采购执行中重要环节需关注的难点,提出行之有效的优化措施。

摘要：目的了解天津市轮状病毒(RV)腹泻发病状况,以及临床及流行病学特征。方法在天津市不同区域设立5所医院,对就诊的感染性腹泻患者按设计的调查内容做现场调查、采集粪便标本,采用ELISA方法检测RV抗原,并以RT-PCR方法做型别分析。结果 1 085例患者中207例检出RV抗原,阳性率为19.08%,其中≤5岁患者的阳性率达32.20%。基因型以G3、G1及P[8]为主,分别占31.88%、17.87%和25.12%。感染存在区域间的聚集性,秋冬季高发。散居儿童患者的阳性率达31.85%。患者发病到初诊平均为(1.63±5.03)d,39.65%在发病当天就诊。RV腹泻患者每日腹泻的次数明显多于非RV腹泻患者,且多为水样便。便常规检测RV腹泻患者的白细胞数均≤10/HPF。患者的年龄、性别、饮食等卫生习惯经Logistic逐步回归分析,变量均无统计学意义。结论天津市感染性腹泻患者19.08%为RV所致,≤5岁患者更是多达32.20%,已经成为公共卫生问题。RV感染的危险因素与非RV腹泻患者类似。

摘要：人腺病毒(Human adenovirus,HAd Vs)可引起包括急性呼吸道感染、胃肠炎、流行性角结膜炎等多种人群疾病。其中儿童、新兵及免疫力低下人群是最易感人群。到目前为止,HAd V-B3、B4、B7和新近出现的14型、55型等基因型,常导致严重肺炎。目前美国FDA批准在17~50岁的军人中使用口服4型和7型腺病毒活疫苗,大量的临床试验和正在进行的发热性呼吸道疾病监测均证明此口服活疫苗是安全和高效的。然而,目前没有批准在儿童和成人中普遍使用的疫苗。六邻体蛋白是腺病毒主要的抗原蛋白,该蛋白前中段含有大量的保守区,有很好的抗原性,是制备通用型腺病毒疫苗的重要候选蛋白,也是研制抗体检测试剂的理想抗原。本研究通过计算机分析,从六邻体蛋白内筛选出高度保守的抗原表位,将多个抗原表位串联成融合蛋白。利用基因工程技术,构建了高表达抗原表位融合蛋白的工程菌,纯化获得了表达的融合蛋白,并建立了融合蛋白的复性方法。复性的融合蛋白配伍不同的免疫佐剂分别免疫小鼠,检测抗血清免疫效价及相关细胞因子水平,评价其体液免疫和细胞免疫特性,结果,免疫后的小鼠产生了高效价、高特异性的血清抗体,并引起了较强的细胞免疫,显示表达制备的抗原表位融合蛋白可以引起体液免疫和细胞免疫,有希望用于研制通用型腺病毒疫苗。用制备的表位融合蛋白作抗原,研制的腺病毒抗体免疫层析检测试剂,具有很好的检出率和特异性。

摘要：三百多年来钢琴艺术以另人难以置信的速度飞速的发展着,钢琴艺术已经成为了人们生活中不可缺少的调味品。现在学习钢琴的孩子越来越多,不仅带给了他们丰富多彩的艺术生活还开发了他们的智力。那么我们在学习钢琴时要注意哪些问题才能达到事半功倍的效果呢?本文将简单的谈一下学习钢琴不可忽视的几个问题。