摘要：为探究三方基序蛋白74(TRIM74)对流感病毒复制的影响,本研究设计并合成靶向TRIM74基因的siRNA,即siTRIM74-331,将其转染A549细胞后,利用荧光定量PCR检测siTRIM74-331对细胞中TRIM74转录水平的干扰效率,利用细胞活力检测试剂盒检测该siRNA对细胞活力的影响。结果表明siTRIM74-331的干扰效率较好且不影响细胞活力。将siTRIM74-331转染A549细胞后感染禽流感病毒(AIV)A/WSN/1933株(WSN),并于感染后24 h、48 h分别进行噬斑滴定,结果显示干扰TRIM74的表达可抑制流感病毒的复制。利用慢病毒包装系统构建TRIM74过表达细胞系(A549-pLVX-TRIM74)和对照细胞系(A549-pLVX),并经qPCR及western blot鉴定正确后,将WSN株(MOI 0.01)分别感染上述两种细胞,并于感染后24 h、48 h收集细胞上清分别进行噬斑滴定。结果表明,过表达TRIM74能够显著促进流感病毒的复制。将WSN株(MOI 5)分别感染A549细胞和HEK293T细胞后,分别采用qPCR和western blot检测细胞中内源TRIM74的转录及蛋白表达水平,结果表明WSN能够刺激细胞内源TRIM74的转录与表达,推测宿主细胞可能通过增强TRIM74的表达响应流感病毒的感染。为探究TRIM74在宿主细胞天然免疫反应中发挥的作用,将不同剂量的表达质粒pTRIM74-V5转染HEK293T细胞,经western blot确定其能够在细胞中呈剂量依赖性表达后,将上述剂量的p TRIM74-V5与p RL-TK、pIFN-β-Luc报告质粒共转染HEK293T细胞(1组);同时将上述剂量的pTRIM74-V5与p RL-TK、pISRE-Luc报告质粒共转染HEK293T(2组),24 h后感染仙台病毒(SeV),12 h后采用双荧光素酶试验检测过表达TRIM74对IFN-β和ISRE启动子活性的影响。结果显示,转染空载体的对照细胞在感染SeV后上述两种启动子的活性均升高,而1组和2组细胞中该两种启动子的活性均极显著下降,且随pTRIM74-V5转染量的升高二者的活性均呈下降趋势。分别将SeV和poly(I:C)刺激TRIM74过表达及干扰其表达的HEK293T细胞,12 h后采用q PCR分别检测各组细胞中IFN-β和ISG56 mRNA的转录水平。结果显示,TRIM74过表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著低于转染空载体的阴性对照细胞;干扰TRIM74表达的各组细胞中IFN-β及ISG56 mRNA的转录水平均显著高于未刺激的Mock组细胞,且均极显著或者显著高于转染NC siRNA的阴性对照细胞,表明TRIM74能够负调控细胞中相应干扰素的分泌。本研究结果首次表明TRIM74能够促进流感病毒的复制,并负调控宿主细胞中IFN-β信号通路,该研究丰富了流感病毒与宿主因子间的调控网络,为深入了解TRIM74蛋白的功能奠定了实验基础。

摘要：针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物,建立了一种RT PCR鉴别方法,其目的片段大小分别为358bp、377bp。经对A/goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/Turkey/England/N28/73(H5N2)、A/Africanstarling/983/79(H7N1)和A/Turkey/Wiscosin/1/66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增,扩增片段的大小与预期大小完全相符。经对国内不同地区分离的16株AIVN1亚型和21株AIVN2亚型用RT PCR方法检测,阳性检出率分别为87.5%(14/16)和95.2%(20/21);对50份样品进行盲检,准确率为98%(49/50)。

摘要：A型流感病毒(IAV)在宿主细胞内复制过程中需要许多宿主因子的参与,同时IAV也能调控多种宿主因子的表达。为寻找调控IAV复制的宿主因子,本研究通过SDS-PAGE电泳检测发现H1N1亚型流感病毒A/WSN/1933株(简写为WSN)感染A549细胞会上调表达55 ku左右的特异蛋白条带(感染后9 h),将该55 ku左右的蛋白条带切胶回收后进行质谱分析,根据质谱分析的筛选标准选择蛋白得分(Mass score)较高、谱图数(Matches)和序列数(Sequences)较为可信的宿主因子DBNL作为调控IAV复制的潜在研究对象进一步研究。本研究针对DBNL设计特异的siRNA和对照Scrambled siRNA,将其分别转染A549细胞,通过荧光定量PCR确定DBNL siRNA在转录水平的干扰效果显著;利用细胞活力测定试验确定DBNL siRNA的干扰不影响细胞活力。利用DBNL siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染该细胞,在感染后24 h、48 h分别收集细胞上清,利用MDCK细胞进行噬斑滴定试验。试验结果显示,与对照组相比,下调表达DBNL后IAV的滴度极显著降低(P<0.01),表明下调表达DBNL能够抑制A549细胞中的IAV复制。利用siRNA下调表达A549细胞中的DBNL后,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后6 h,对照组中红色荧光集中分布在细胞质中,而DBNL siRNA组中红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明下调表达DBNL能够抑制细胞中IAV NP蛋白的出核。反之,通过转染过表达DBNL的重组质粒,以WSN感染A549细胞,采用激光共聚焦试验鉴定IAV NP蛋白的表达与定位情况。结果显示,在病毒感染后4 h,转染pCAGGS的对照组中红色荧光主要分布在细胞核中,而过表达DBNL组中的红色荧光在细胞核与细胞质中均有分布,表明过表达DBNL能够促进细胞中IAV NP蛋白的出核。以上研究结果证实DBNL正调控IAV的复制与其NP蛋白的出核。本研究丰富了DBNL功能的多样性,为宿主因子调控IAV复制的研究提供参考数据。

摘要：核蛋白(NP)是流感病毒的主要结构蛋白,其与RNA依赖性的聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)及vRNA构成核糖核蛋白复合体,参与流感病毒复制过程中的多个阶段。宿主因子着丝粒蛋白V(CENPV)在细胞生命周期中发挥重要作用,但是目前尚未见关于CENPV蛋白与流感病毒NP蛋白相互作用的报道。为研究宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白相互作用机制,本实验利用酵母双杂交技术筛选与NP蛋白相互作用的CENPV,利用酵母回交验证,结果显示CENPV与NP诱饵质粒共同转化Y2H酵母感受态细胞,在DDO、QDO和QDO/X/A 3种营养缺陷型的培养基上均能生长,并使菌落呈现蓝色,与阳性对照结果一致,而阴性对照组在QDO和QDO/X/A培养基上均未观察到菌落,表明在酵母系统中宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用。将pCAGGS-CENPV-Myc(1μg)表达质粒与pCAGGS-NP(1μg)质粒共转染293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)检测,结果显示鼠抗NP MAb仅可结合CENPV与NP共转染组中的CENPV,表明宿主蛋白因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在相互作用;进一步利用激光共聚焦试验检测,结果显示在A549细胞中宿主因子CENPV与流感病毒的NP蛋白存在共定位。根据人CENPV序列设计合成CENPV的特异性siRNA,利用RNAiMAX将CENPV siRNA转染A549细胞,48 h后进行细胞活力测定和病毒感染试验,结果显示利用siRNA干扰技术下调CENPV表达后对细胞活力无影响,但可促进流感病毒在A549细胞中的复制。以上研究结果首次证实宿主因子CENPV与流感病毒NP蛋白存在相互作用,并且调控流感病毒的复制。本研究进一步完善了流感病毒NP蛋白与宿主因子的相互作用网络,为宿主因子调控流感病毒复制研究提供参考。

摘要：为探究宿主因子磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)调控A型流感病毒复制的机制,本研究设计并合成PGAM5 siRNA和阴性对照Scrambled siRNA(NC siRNA),将二者分别转染A549细胞后,采用荧光定量PCR(qPCR)和western blot(WB)检测该siRNA的干扰效果,利用细胞活力试剂盒检测下调PGAM5表达对细胞活力的影响。结果显示,与转染NC siRNA的阴性对照细胞相比,PGAM5 siRNA能够极显著抑制PGAM5在A549细胞中的转录及表达水平(P<0.001、P<0.01)且对细胞活力基本无影响。为探究PGAM5对流感病毒复制的影响,将PGAM5siRNA和NC siRNA分别转染A549细胞36 h后经流感病毒A/WSN/1933(WSN,H1N1)株感染,分别于感染后24 h、48 h及72 h收获上清经噬斑滴定测定各组细胞中的病毒滴度;分别于感染后3 h~5 h采用WB检测病毒各蛋白的表达水平。结果显示,与阴性对照细胞相比,随着感染时间的延长,转染PGAM5 siRNA细胞中的病毒滴度均极显著下降(P<0.001),尤其在转染后72 h病毒滴度下降最多;且该细胞中流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1和NS1蛋白的表达水平均呈下降趋势,以感染后3 h上述蛋白表达水平的降低最为显著。为探究PGAM5调控流感病毒复制的机制,将PGAM5 siRNA和NC siRNA分别转染A549细胞,36 h后以MOI 10 WSN株感染细胞,1 h后分别采用WB检测病毒NP蛋白的表达水平,分析PGAM5对流感病毒吸附和内吞的影响,并于感染后0、3 h、4 h及5 h通过激光共聚焦试验检测细胞内病毒NP蛋白的定位,以确定下调PGAM5对流感病毒vRNP复合体入核及出核的影响,采用Image J统计含病毒NP蛋白的细胞在v RNP复合体入核及出核中的比例。结果显示,与对照组相比,下调PGAM5基因的表达后,吸附在细胞表面或内吞进入各组细胞中的病毒粒子中NP蛋白的表达水平均无显著差异。激光共聚焦观察可见,在下调PGAM5表达的细胞中,病毒NP蛋白先定位于细胞表面,再向细胞核内聚集,而后完成出核、最后定位在细胞质中,与阴性对照细胞结果一致;但在该组细胞中,病毒NP蛋白趋向出核以及完成出核的细胞比例均显著低于阴性对照细胞(P<0.05)。将p CAGGS、pCAGGS-PGAM5及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-Importinα1/3/5/7-Flag/PGAM5和pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-Importinβ1-Flag以及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-Importinβ1-Flag分别转染HEK293T细胞,24 h后利用Co-IP试验检测PGAM5与核输入蛋白的相互作用;将pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-NS2-Flag及pCAGGS-PGAM5+pCAGGS-NS2-Flag和pCAGGS-PGAM5、pCAGGS-M1-Myc及pCAGGSPGAM5+pCAGGS-M1-Myc分别转染HEK293T细胞,24 h后经Co-IP试验检测PGAM5与核输出蛋白的相互作用。结果显示,PGAM5与核输入蛋白Importinα1/α3/α5/α7及Importinβ1及核输出蛋白M1/NS2均无相互作用。提示,宿主因子PGAM5可能并非通过与M1/NS2的互作调控流感病毒vRNP复合体的出核。本研究首次报道宿主因子PGAM5可以促进流感病毒的复制,且其主要参与调控流感病毒vRNP复合体的出核过程。本研究为深入了解PGAM5蛋白功能奠定了研究基础,也为流感的防控提供了新思路。

摘要：本实验室前期通过质谱分析筛选到宿主因子II型角蛋白2(KRT2),推测其可能与流感病毒复制相关。为进一步研究KRT2对流感病毒复制的影响,本研究将真核表达质粒pCAGGS-KRT2-Myc转染至HEK293T细胞24 h后,感染A/WSN/1933(H1N1)株病毒,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测过表达KTR2蛋白对流感病毒复制影响,结果显示,过表达KRT2蛋白后流感病毒滴度和NP蛋白表达均下降;激光共聚焦试验检测结果显示,过表达KRT2蛋白后,流感病毒复制早期NP蛋白向细胞核内的聚积受到了抑制。针对KRT2基因设计特异性siRNA-1/2,转染A549细胞后采用细胞活力检测试剂盒检测下调KRT2蛋白表达后对A549细胞活力影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测干扰效率,筛选最佳siRNA,结果显示,与对照siRNA相比,KRT2特异性siRNA处理不影响A549细胞活力,且siRNA-2能更有效降低KRT2的表达。以A/WSN/1933(H1N1)株病毒感染siRNA-2转染后的A549细胞,采用噬斑滴定、western blot及激光共聚焦技术检测siRNA-2干扰下调KTR2蛋白表达对流感病毒复制影响,上述试验结果均显示,KRT2表达下调后病毒滴度和NP蛋白表达均显著提高;激光共聚焦试验结果显示,下调KRT2蛋白表达后,流感病毒在复制早期阶段受到了抑制。本研究结果首次表明,KRT2是一种负调控流感病毒复制的宿主因子。本研究丰富了流感病毒与宿主因子互作的网络,也深化了对宿主因子影响流感病毒复制机制的认知。